生物化学实验五 DNA限制性酶切和琼脂糖凝胶电泳.ppt

实验五

DNA限制性酶切和

琼脂糖凝胶电泳限制性内切酶EcoRIRestrictionEnzyme识别序列：------G↓AATTC------------CTTAA↓G------HindIIIRestrictionEnzyme识别序列：------A↓AGCTT------------TTCGA↓A------每一种限制性内切酶都有特定的反应条件pH范围：7.5~8.0缓冲液组份:Tris(三羟甲基氨基甲烷）NaCl、MgCl2、巯基乙醇温度：37℃琼脂糖凝胶电泳是一种简便、快速的分离纯化和鉴定核酸的方法。琼脂糖是一种线性多糖聚合物。琼脂糖粉末加热到熔点后冷却凝固,会形成良好的电泳介质。电泳在电场的作用下，在某种支持介质上，将一个混合物分离成若干条区带的过程。琼脂糖凝胶的浓度与DNA分离范围琼脂糖浓度(%)线型DNA分离范围(Kb)0.35～600.61～200.70.8～100.90.5～71.20.9～61.50.2～312.00.1～2试剂TBE电泳缓冲液45mmol/LTris-硼酸，1mmol/LEDTA，pH8.0加样缓冲液0.25%溴酚蓝（深蓝色，300bp)0.25%xylenecyanloFF（天蓝色，2000bp）40%蔗糖EB（溴化乙锭）染色液（有毒）0.5ug/ml，用水配制溴化乙锭(ethidiumbromide，EB)是一种扁平分子荧光染料，可嵌入核酸的碱基对之间，在紫外线激发下，发出桔红色荧光。电泳结束后，将凝胶浸入0.5ug/ml的EB溶液中染色10min。在紫外光照射下可见核酸电泳带，DNA量一般5ng。操作步骤酶切反应反应体系λ－DNA5ul10xBuffer2ulHindIII3ulH2O10ulTotal20ul混匀，37度保温30分钟制胶用电极缓冲液（0.5×TBE）配制0.7%的琼脂糖胶20mL0.14g琼脂糖，20mL0.5×TBE微波炉加热至沸腾，确定琼脂糖完全溶解冷却至60℃左右准备好梳子和胶槽，倒入琼脂糖溶液，冷却凝固点样Sample1自提DNA5ul+2ulLoadingDyeSample2自提DNA酶切液20ul+4ulLoadingDyeSample3λ-DNA5ul+2ulLoadingDyeSample4λ-DNA酶切液20ul+4ulLoadingDye点样：Sample1和3各7ulSample2和4各10ul电泳接通电源，150v电泳0.5小时染色和观察切断电源，取出胶模，将凝胶放入EB染色液中，染色10分钟取出凝胶，紫外灯下观察DNA电泳带型警告EB诱变染色和观察时一定要带手套！