生物化学实验四 植物DNA的提取和鉴定.ppt

植物DNA的提取与鉴定实验四实验原理真核生物的DNA与组蛋白结合，以DNA核蛋白的形式存在于细胞核内。在提取DNA时，通过研磨破坏细胞壁和细胞膜，释放出DNA核蛋白。实验原理在1.4mol/LNaCl中，DNA核蛋白的溶解度大，RNA核蛋白的溶解度小。在0.14mol/LNaCl中，DNA核蛋白溶解度小，RNA核蛋白溶解度大。①氯仿-异戊醇使蛋白质变性，离心除去变性蛋白。②十二烷基硫酸钠（SDS）使蛋白质变性，与核酸分离，从材料中提取出DNA。③苯酚使蛋白变性，离心分层，后者停留在酚层内。去除蛋白质的方法①化学因素：pH4.0-11.0稳定，否则变性降解。②物理因素：DNA是长链线状分子，机械剪切作用会使分子断裂。③酶的作用：DNA酶降解DNA分子。破坏DNA完整结构的因素紫外光吸收法鉴定DNA纯度和浓度核酸的紫外吸收260nm,蛋白质280nmDNA的A260/A280约1.8，RNA的约2.050ug/mLDNA溶液，A260=1.040ug/mLRNA溶液，A260=1.0实验步骤10mLCTAB提取缓冲液加入50mL离心管中，65℃水浴中预热。50-60g植物叶片，置于预冷的研钵中，倒入液氮，充分研磨10分钟。（全班共用）每组取约2g叶片粉末，加入预热的CTAB提取缓冲液中，轻轻混匀，65℃保温30分钟。加10mL氯仿-异戊醇，振荡2-3分钟。5000rpm离心5分钟。用塑料滴管将上清吸入另一支50mL离心管中，加入等体积的异丙醇，轻轻混匀，静置3-5分钟。用玻棒将DNA搅起，置于10mL70％乙醇中浸泡5分钟。（如果沉淀量很少，5000rpm离心，弃上清，乙醇浸泡沉淀。）将DNA沉淀在室温干燥5-8分钟。将DNA沉淀溶于100mLTE缓冲液中。测定A260和A280计算鉴定DNA的纯度和含量试剂CTAB提取液2.0%CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）1.4mol/LNaCl20mmol/LEDTA100mmol/LTris-HCL（pH8.0）0.2%巯基乙醇CTABCTAB是阳离子去污剂,能使蛋白质变性，还能与核酸形成特异的核酸-CTAB复合物。核酸-CTAB复合物可溶于≥0.7mol/LNaCl的高盐缓冲液。