生物化学实验六 酵母醇脱氢酶的提取与纯化.ppt

酵母醇脱氢酶的提取和纯化实验目的掌握蛋白质提取、纯化、浓度测定和酶活性测定的原理和方法。实验原理分离纯化用热变性、有机溶剂沉淀等方法，从酵母中提取一定纯度的醇脱氢酶。CH3CH2OH+NAD+CH3CHO+NADH+H+乙醇过量时，NAD+被还原成NADH的速度与酶活力成正比，NADH在340nm有较强吸收，可测定单位时间内NADH的生成量，确定酶活力。醇脱氢酶醇脱氢酶催化的反应醇脱氢酶可催化醇和醛之间的氧化还原反应，辅酶是NAD+/NADH。实验步骤一、提取纯化酵母醇脱氢酶（一）粗提称酵母粉2g，置研钵中，加半勺石英沙和Na2HPO4溶液5mL，用力研磨10分钟，转入50mL离心管，用20mLNa2HPO4溶液洗研钵，转到离心管中，摇匀，静置5分钟，5000rpm离心5min，取上清液，量取体积V1，取2个1ml分别于1.5ml离心管中，4℃保存（一管用于测蛋白浓度，一管用于测酶活力），剩余的上清继续下一步纯化。（二）热变性去除杂蛋白剩余的上清在55℃保温15min，间歇搅拌，冰浴冷却，5000rpm离心5min，取上清，量体积V2，取2个1ml分别于1.5ml离心管中（一管用于测蛋白浓度，一管用于测酶活力），4℃保存备用，剩余上清置冰浴中。（三）有机溶剂沉淀杂蛋白将置于冰浴中上清，加上清体积一半的预冷丙酮，混匀，4℃静置5min，5000rpm，离心5min，取上清，量体积V3，取2个1ml分别于1.5ml离心管中，4℃保存备用（一管用于测蛋白浓度，一管用于测酶活力），剩余上清倒入已置于冰浴中的50ml离心管。（四）有机溶剂沉淀酶蛋白在上清中按100ml加55ml丙酮的比例，加入预冷丙酮，混匀，静置5min，4℃，5000rpm离心5min。弃上清，沉淀溶于5.0ml0.01mol/LK2HPO4中，体积为V4，取2个1ml分别于1.5ml离心管中（一管用于测蛋白浓度，一管用于测酶活力）。1、将前面保存的上清用0.01mol/LK2HPO4稀释第一步、第二、三、四步的酶液各稀释10倍备用2、准备5只试管，编号1-5，加入以下四种试剂3.0M乙醇0.1ml0.06M焦磷酸钠0.5ml0.0015MNAD+0.3ml蒸馏水1.6ml酶活力测定方法3.逐管加入0.2mL已稀释的酶液，混匀后立即测定A340每分钟A340增加0.001为1个活力单位。样品编号A340/min1mL酶原液的酶活(U/mL)V1V2V3V4酶液加入体积：0.2mL酶液稀释倍数：10倍1mL酶原液的酶活=A340*1000*10/0.2酶活定义：每分钟A340增加0.001为1个活力单位。考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合，最大吸收波长在595nm，在0～100μg/ml，吸光度与蛋白质含量成正比。

蛋白质与G-250反应在2min内达到平衡，且稳定，可检测微克级的蛋白质。蛋白质含量测定（Bradford法）取6个PA瓶，配制0～100μg/ml蛋白液各1.0ml。加5.0mlG-250试剂，混匀，放置2min，在595nm比色，绘制标准曲线。1、蛋白质标准曲线的制作管号123456蛋白质标准液（ml）00.20.40.60.81蒸馏水（ml）1.00.80.60.40.20考马斯亮蓝染液555555蛋白质含量（μg）020406080100A595将样品提取液稀释50倍（参考值），吸取1.0mL放入PA瓶，加5mLG-250试剂，混匀，放置2min，在595nm比色，记录吸光度值，通过标准曲线查得蛋白质含量。2、样品提取液中蛋白质浓度的测定（四）计算（按照测定的数据完成下表）

C=A×BE=A×DF=D/B（或E/C）提纯步骤总体积mlA蛋白浓度(mg/ml)B蛋白总量mgC1mL酶活力（U）D总活力UE比活力(U/mg)F回收率（%）蛋白质G酶总活力H1.粗提22.51.98644.6145032625731.51001002.热变