DB13_T2593-2017_禽腺病毒4型PCR检测方法_河北省.docxVIP

ICS11.220

DB13

B43

河北省地方标准

DB13/T2593—2017

禽腺病毒4型PCR检测方法

河北省质量技术监督局

发布

DB13/T2593—2017

前

言

本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。

本标准由河北农业大学提出。

本标准起草单位：河北农业大学。

本标准主要起草人：袁万哲、王建昌、孙继国、刘聚祥、李丽敏、陈立功、李睿文、张磊、白云、

陈赛娟、李杰峰。

I

DB13/T2593—2017

禽腺病毒4型PCR检测方法

1

范围

本标准规定了禽腺病毒4型PCR检测方法的技术要求。

本标准适用于检测家禽咽喉拭子、肛拭子，发病禽组织和这些采集样品培养物中的禽腺病毒4型。

2

术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

2.1

DNA

脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid）

2.2

2.3

2.4

EB

溴化乙锭（ethidiumbromide）

3

包括各种市售病毒核酸提取试剂盒，1.0%琼脂糖凝胶，50×TAE缓冲液，溴化乙锭（EB，10ug/μL）

或核酸染料，焦碳酸二乙酯（DEPC）处理的灭菌的双蒸水，DNA分子量标准（100bp），2×TaqMasterMix

或商品化的一步法PCR反应试剂。

警示:电泳中用到的EB在操作中应戴手套和口罩。试验中被EB污染的物品要进行无害化处理；DEPC

在操作中应在通风条件下进行，使用时戴手套和口罩，不小心沾到皮肤应立即冲洗。

3.21.0%琼脂糖凝胶，配制方法见附录A中A.1。

3.350×TAE缓冲液，配制方法见附录A中A.2。

3.4溴化乙锭（EB，10ug/μL）或核酸染料，配制方法见附录A中A.3。

3.5焦碳酸二乙酯（DEPC）处理的灭菌的双蒸水，配制方法见附录A中A.4。

1

DB13/T2593—2017

3.6DNA分子量标准（100bp）:包含100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp、2000bp几种分

子量标准。

3.72×TaqMasterMix。

3.8商品化的一步法PCR反应试剂：含有PCR缓冲液、酶混合物、dNTP混合物、无RNA酶的水等。

3.9引物：上游引物与下游引物见附录B中的表B.1。引物浓度为10μmol/L。

4

仪器设备

4.1PCR仪：温度范围4.0℃～99.9℃；样品基座配置至少包括单个0.2mL孔。

4.2凝胶成像系统：检测灵敏度DNA≥0.1ng；有效像数1360×1024、10bit、USB2.0。

4.3台式低温高速离心机：最高转速16000r/min；容量1.5mL×12。

4.4电泳仪：电压50V～120V，电流10mA～800mA，定时0min～999min。

4.5电泳槽:耐高温、耐腐蚀、不漏液；缓冲液容量充足。

4.6冰箱:具有冷藏功能。

4.7微量移液器:单道可调；量程包括0.5～10μL、2～20μL、10～100μL、100～1000μL。

4.8水浴锅:温度范围为室温～100℃。

5

以灭活的禽腺病毒4型鸡胚尿囊液作为阳性对照，以正常鸡胚尿囊液或者是正常家禽组织作为阴性

对照。对照均应在-20℃保存。

将棉拭子深入咽喉或肛门转一圈；将采集后的棉拭子放入盛有1.0mLPBS（配制方法见附录A中A.5）

的1.5mL的离心管，加盖，编号。

2

DB13/T2593—2017

剖检家禽，用剪刀采集心肝脾肺肾法氏囊等组织，装入一次性灭菌容器，编号。

5.2.4

样品储运

样品采集后放入塑料袋内密封（一个采集点的样品放一个塑料袋内），于保温箱中加冰，密封24h

内送至实验室。

5.2.5

样品的处理

5.2.5.1

棉拭子处理方法

将装有棉拭子的离心管在混合器上充分混合后，用高压灭菌的镊子将拭子中的液体挤出，4℃条

件下3000r/min离心15min，取上清液转入无菌的1.5mL离心管中，编号备用。

5.2.5.2

组织的处理方法

将所采集的组织置于洁净、灭菌并烘干的搪瓷盘中，称取组织按照质量体积比（1:5）加入样品保

存液进行充分研磨，4℃条件下3000r/min离心15min。取上清转入无菌的1.5mL的离心管备用，编号。

6

操作步骤

6.1DNA的提取

用病毒核酸提取试剂盒，按照如下步骤提取待检样品、阳性对照及阴性对照样品的DNA。

6.1.1加入20μL蛋白酶K于1.5mL离心管中，在离心管中加入200μL样品，加入200μLBB5，

涡旋混合15s，56℃孵育15min。

6.1.5室温12000