DB22_T1676-2012_冻鲜鱿鱼多种致病菌的测定多重PCR法_吉林省.docxVIP

ICS67.120.30

B50

DB22

备案号：35809-2013

吉

林

省

地

方标准

DB22/T1676—2012

冻鲜鱿鱼多种致病菌的测定多重PCR法

Determinationoffood-bornebacterialpathogensfromfrozensquid——

MultiplePCR

吉林省质量技术监督局

发布

DB22/T1676—2012

前

言

本标准按照GB/T1.1-2009和GB/T20001.4给出的规则起草。

本标准由珲春出入境检验检疫局提出并归口。

本标准起草单位：中华人民共和国珲春出入境检验检疫局综合实验室、吉林农业大学。

本标准主要起草人：聂丹丹、王宁宁、陶希三、杨文光、席家文、谭立新、李晶、张琦、宋立甫、

赵欣玥。

I

DB22/T1676—2012

冻鲜鱿鱼多种致病菌的测定多重PCR法

1范围

本标准规定了冻鱿鱼中沙门氏菌Salmonella、单核细胞增生李斯特氏菌Listeriamonocytogenes、

副溶血性弧菌Vibrioparahemolyticus及霍乱弧菌Vibriocholerae的多重PCR方法。

本标准适用于冻鱿鱼中沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、副溶血性弧菌及霍乱弧菌的测定。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。

凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB4789.4食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验

GB4789.7食品卫生微生物学检验副溶血性弧菌检验

GB/T4789.20食品卫生微生物学检验水产食品检验

GB4789.30食品安全国家标准食品微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB19489实验室生物安全通用要求

SN/T1022进出口食品中霍乱弧菌检验方法

按照WS/T230-2002中6的规定执行。

1

DB22/T1676—2012

5试剂和材料

除另有规定外，所有化学试剂均采用分析纯。

5.1标准菌株

为了保护实验室人员的安全，应由具备资格的工作人员检测沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、

副溶血性弧菌、霍乱弧菌及其他致病菌的所有培养物和小心处置废物，并按GB19489中的有关规定执

行。

阳性菌株：沙门氏菌ATCC12011；单核细胞增生李斯特氏菌ATCC19111；副溶血弧菌ATCC17802；

霍乱弧菌JL.08108。

阴性菌株：（对照采用任意一种非目标菌）李斯特菌ATCC19119；普通变形杆菌ATCC33420；金黄

色葡萄球菌ATCC12600；小肠耶尔森菌ATCC23715；大肠杆菌ATCC11229；克雷伯氏菌ATCC43086；粪

肠球菌ATCC14500；蜡样芽胞杆菌ATCC11176。

5.2试剂

5.2.1水：应符合GB/T6682中一级水的规格。

5.2.2DNA提取液：主要成分是CTAB，Tris，EDTA。

5.2.3蛋白酶K。

5.2.4RNA酶。

5.2.5三氯甲烷（氯仿）CHCl3。

5.2.6异戊醇C5H12O。

6.3凝胶分析成像系统。

2

DB22/T1676—2012

7检测程序

普通PCR方法检测程序参见附录B。

8样品制备

样品应冷冻保存，解冻后应尽快依照GB/T4789.20的相关规定，在无菌条件下对鱿鱼进行局部取样，

取样25g（mL）加入到含有225mL无菌培养液中，在拍击式均质器上连续均质1min～2min。

9操作步骤

9.1增菌培养和分离

9.1.1沙门氏菌按照GB4789.4方法进行。

9.1.2单核细胞增生李斯特氏菌可按照GB4789.30方法进行。

9.1.3副溶血性弧菌按照GB4789.7方法进行。

9.1.4霍乱弧菌按照SN/T1022方法进行。

9.2细菌模板DNA的提取

对于上述方法培养的增菌液，各取增菌液1mL均加到一个1.5mL无菌离心管中，8000r/min离心5

min，吸弃上清液，加入500μLCTAB、40μL蛋白酶K，震荡均匀，65℃温浴30min；加入500μL三

氯甲烷：异戊醇（24：1），震荡，12000r/min离心15min；吸取上层水相至1.5mL离心管中，加

入等体积的异丙醇，震荡均匀，12000r/min离心10min；弃上清液，用预热至65℃TE缓冲液溶解

DNA（TE量视DNA沉