DB22_T2051-2014_饲料中肉毒梭菌测定PCR方法_吉林省.docxVIP

ICS07.100.30

B20

DB22

吉林省地方标准

DB22/T2051—2014

饲料中肉毒梭菌测定PCR方法

DeterminationofClostridiumbotulinuminfeedstuffs

PCRmethod

吉林省质量技术监督局

发布

DB22/T2051—2014

前

言

本标准按照GB/T1.1-2009和GB/T20001.4-2001给出的规则起草。

本标准由吉林省质量技术监督局提出并归口。

本标准主要起草单位：吉林省产品质量监督检验院、国家农业深加工产品质量监督检验中心、中华

人民共和国吉林出入境检验检疫局、中华人民共和国顺德出入境检验检疫局。

本标准主要起草人：史艳宇、刘金华、邵秋荣、刘斌、周亮、刘晓晖、王潇、任明月。

I

DB22/T2051—2014

饲料中肉毒梭菌测定PCR方法

1范围

本标准规定了饲料中肉毒梭菌的PCR检验方法。

本标准适用于饲料中A、B、E、F型肉毒梭菌的快速筛选检测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测

下列术语和定义适用于本文件。

肉毒梭菌为梭菌科梭菌属革兰氏阳性芽孢杆菌，厌氧，在适宜的培养基及特定的环境条件下产生一

类具有很强毒性的神经麻痹毒素，即肉毒毒素。

样品增菌后，培养物经DNA提取制备PCR模板，进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物是否

有特征条带，从而对饲料中是否污染肉毒梭菌进行快速检验。

除特别说明以外，所有试剂均为分析纯，水为按照GB/T6682规定的一级水。所有试剂均用无DNA

1

DB22/T2051—2014

表1引物序列

扩增长度

目标菌类型

引物序列

bp

上游引物：5’-GTGATACAACCAGATGGTAGTTATAG-3’

下游引物：5’-AAAAAACAAGTCCCAATTATTAACTTT-3’

上游引物：5’-GAGATGTTTGTGAATATTATGATCCAG-3’

下游引物：5’-GTTCATGCATTAATATCAAGGCTGG-3’

上游引物：5’-CCAGGCGGTTGTCAAGAATTTTAT-3’

下游引物：5’-TCAAATAAATCAGGCTCTGCTCCC-3’

上游引物：5’-GCTTCATTAAAGAACGGAAGCAGTGCT-3’

下游引物：5’-GTGGCGCCTTTGTACCTTTTCTAGG-3’

A型

B型

E型

F型

983

492

410

1137

5.2疱肉培养基：见附录A.1章。

5.3胰蛋白胨葡萄糖酵母浸膏肉汤（TPGY）：见附录A.2章。

5.4厌氧卵黄琼脂：见附录A.3章。

5.5细菌基因组DNA提取纯化试剂盒。

5.6TaqDNA聚合酶。

5.7dNTP：dATP（deoxyadenosinetriphosphate，脱氧腺苷三磷酸）、dGTP（deoxyguanosina

triphosphate，脱氧鸟苷三磷酸）、dCTP（deoxycytidinetriphosphate，脱氧胞苷三磷酸）、dTTP

（deoxythymidinetriphosphate，脱氧胸苷三磷酸）。

5.8溶菌酶。

5.14乙二胺四乙酸二钠盐（EDTA-Na2·2H2O）。

5.1510×PCR缓冲液：含200mmol/LTris-HCl（pH8.4），200mmol/L氯化钾（KCl），15mmol/L

氯化镁（MgCl2）。

5.19EDTA溶液，0.5mol/L，pH8.0：称取186.1gEDTA-Na2·2H2O，加入700mL去离子水中，在磁

力搅拌器上剧烈搅拌，用10mol/L氢氧化钠调pH值至8.0，用水定容到1L，分装后高压灭菌。

5.20Tris-HCl，1mol/L，pH8.0：在800mL去离子水中溶解121.1gTris，冷却至室温后用浓盐酸

调节溶液的pH值至8.0，加水定容至1L，分装后高压灭菌。

5.21TE缓冲液（pH8.0）：在800mL水中，依次加入10mL的1mol/LTris-HCl（pH8.0）和2mL

的0.5mol/LEDTA（pH8.0），用水定容到1L，分装后高压灭菌。

5.22溶