三维超分辨显微成像技术的研究进展.docxVIP

1.??引言

传统光学显微成像技术能够清晰分辨出三维亚细胞结构，这对细胞生物学研究来说是必不可少的。然而由于阿贝衍射极限的存在，传统光学显微镜的分辨率受到了限制。

在可见光波段，传统光学显微镜的横向分辨率仅为200～300nm，轴向分辨率为横向分辨率的1/3～1/2，只能达到500～800nm。显然，这两个尺寸都远大于许多亚细胞结构。

于是，科学家们基于物理和化学方法提出了许多突破光学衍射极限的显微成像技术。在众多技术中，基于荧光标记的超分辨显微成像技术将横向分辨率和轴向分辨率分别提高了至少10倍和6倍，一跃成为当下的研究热点。

荧光显微成像技术都是通过荧光团的亮态(onstate)和暗态(offstate)，按时间顺序记录其亚衍射极限特性，并且荧光分子处于亮态或暗态的概率与激发光强呈非线性相关。通过对荧光团进行坐标定向或者随机时间开关处理，荧光显微镜就能够在亚衍射极限范围内清晰地分辨出荧光标记的细胞结构，实现了从传统光学显微镜到超分辨光学显微镜的转变。通过此原理，科学家们也首次通过荧光显微镜进行了许多基本的生物学研究。

目前，超分辨显微成像主要分为三种技术：第一种技术以受激辐射损耗(STED)显微术为代表。STED采用两束激光，一束用于激发荧光分子产生荧光，另一束中心光强为零的环形损耗光用于损耗荧光并将发光区域限制在衍射极限以下，于是通过点扫描的方式即可实现超分辨成像。第二种技术以单分子定位显微术(SMLM)为主，其代表性技术有光激活定位显微镜(PALM)和随机光学重构显微镜(STORM)。SMLM通过使用激活光和激发光控制成像区域中每次成像时仅有少量、随机、离散的荧光分子发光，再通过高斯拟合得到每个荧光分子高精度的空间定位，最后将所有图片进行叠加，形成一幅超分辨图像。第三种技术是结构光照明显微术(SIM)。SIM通过使用具有空间结构的光束将空间高频成分编码到荧光图像，再通过图像算法解码重构出超分辨图像。

理论上，SIM的分辨率极限为传统光学显微术的两倍，而STED技术和SMLM的分辨率没有限制。

2.?受激辐射损耗显微镜的三维成像技术研究进展

在受激辐射损耗显微成像中，中心光强为零的环形暗斑可以用来提高横向分辨率，但由于轴向上并不能损耗荧光，轴向分辨率并未得到提升。此外，由于像差的存在，成像的深度也受限。因此，在三维成像中，提高轴向分辨率、增大成像深度、实现具有各向同性三维分辨率的深度成像至关重要。

2.1三维分辨率

根据STED的成像原理，要想提升显微成像系统的三维空间分辨率，实现样品的三维超分辨成像，关键是要让损耗光在样品焦平面处聚焦成一个三维中空暗斑，只有暗斑中心所在位置可以发出荧光，其他位置的荧光都被损耗了。要想实现这一点，目前的技术主要有基于单物镜架构的3D-STED和基于双物镜架构的isoSTED。

基于单物镜架构的3D-STED的技术关键是对损耗光加载0/π环形相位(也叫作“Top-hat”相位)，这种相位分布可以让损耗光经过物镜聚焦成具有焦面中心强度最小、焦面上下强度最大分布的三维暗斑。在这种架构(z-STED)下，基于单物镜架构的3D-STED技术相比于共聚焦显微成像技术，可以获得轴向6倍和横向2倍的分辨率提升，即获得90～110nm的近乎各向同性的三维分辨率。为了进一步增大横向的损耗、提升横向分辨率，可以通过再引入一路损耗光加载传统的0～2π涡旋相位，产生一个横向分布的“甜甜圈”形状的环形暗斑，最终将两个暗斑在焦面进行非相干强度叠加，得到横向43nm和轴向125nm的分辨率。

图1：基于单物镜架构的3D-STED纳米显微技术原理图

如图1所示，损耗光经过偏振分束器后分为水平偏振光STEDxy和垂直偏振光STEDz，分别加载0～2π涡旋相位板和0/π环形相位板，二者随后经过偏振分束器合束，接着与激发光通过二色镜合束，最终经过光束扫描组件和1/4波片一起进入物镜。

值得注意的是，为了保证两束损耗光的非相干性并形成高质量的三维暗斑，两束损耗光脉冲在时间上有一定的延迟。

除了可以使用相位板对损耗光进行波前调制，也可以利用空间光调制器(SLM)对其进行波前调制。相位型的液晶空间光调制器往往只能对一种偏振光进行调制，这种偏振光的偏振方向与液晶取向一致。图1展示了这样的一种架构：空间光调制器只对水平偏振光进行调制，其加载的第一个全息图是0～2π涡旋相位，相位的第二个全息图是0/π环形相位；水平偏振光STEDxy和垂直偏振光STEDz，经SLM第一个全息图的调制后，只有损耗光STEDxy受到调制；两束损耗光随后依次经过1/4波片、透镜，再经反射镜原路返回经过透镜、1/4波片，此时原来的垂直偏振光STEDz已经变成水平偏振光，受到SLM第二个全息图的调制，而原来的水平偏振光STEDxy已经