质粒的提取定量鉴定.pptVIP

*取1.5ml培养物加入Eppendorf管中9000rpm×30s，弃上清加入250μl溶液P1中，旋涡振荡，使细菌沉淀分散，彻底悬浮。加入250μl溶液P2，颠倒6～10次混匀（不要剧烈振荡），直到溶液变得清亮（溶液P2为裂解液，故离心管中菌液逐渐变清）。加入400μl溶液P3，立即温和颠倒数次混匀，见白色絮状沉淀，室温放置3-5min。（溶液P3为中和溶液，此时质粒DNA复性，染色体和蛋白质不可逆变性，形成不可溶复合物，同时使SDS-蛋白复合物沉淀），室温13000rpm离心10min，小心取上清液。将吸附柱放于收集管中，加入500μl去蛋白液，室温13000rpm离心1min，弃滤液，将上一步所得上清液加入吸附柱中，13000rpm离心1min，弃滤液。向吸附柱中加入500μl漂洗液WB，13000rpm离心1min，弃滤液。重复步骤6一次。空柱13000rpm离心2min，室温放置3-5min，使残留乙醇挥发。取出吸附柱，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间加50μl无菌水，室温放置1min，13000rpm离心1min洗脱质粒DNA，-20℃保存备用。采用1％琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物、酶切产物以及提取的DNA四、结果分析DNA-marker质粒DNAPCR产物酶切产物点样顺序第62页，共63页，星期日，2025年，2月5日五、预期实验结果M:DL5000DNAMarker1,4,7,10为质粒2,5,8,11为PCR目的条带;3,6,9,12为酶切片段M1234567891011125000bp3000bp2000bp1500bp1000bp750bp500bp250bp100bp酶切长片段含目的DNA片段的酶切短片段第63页，共63页，星期日，2025年，2月5日****************两个引物之间不应发生互补，特别是在引物3’端，即使无法避免，其3’端互补碱基也不应大于2个碱基，否则易生成“引物二聚体”或“引物二倍体”（Primerdimer）。引物内部应避免内部形成明显的次级结构，尤其是发夹结构（hairpinstructures）。*酶活力:单位U:1小时完全消化1μLDNA的酶量为1个单位**PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’端－3’端外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。

*基因的体外突变：采用随意设计的引物，在体外对基因进行嵌合、缺失、点突变等改造。***载体的标准：（1）能自主复制；（2）具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定；（3）有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；（4）分子量小，以容纳较大的外源DNA。***PCR技术的主要用途（一）目的基因的克隆（二）基因突变（三）DNA和RNA的微量分析（四）DNA的序列测定（五）基因的突变分析第30页，共63页，星期日，2025年，2月5日PCR的临床应用遗传病的诊断：β-地中海贫血诊断、产前诊断、肝癌研究、α-1抗胰蛋白酶缺陷症、苯丙酮尿症、痛风病等诊断研究生物识别：PCR已用于人免疫缺陷病毒（HIV）、乙肝病毒（HBV）、人乳头瘤病毒（HPV）等十几种病毒检测癌基因的研究：选择肿瘤基因突变部位进行扩增，可协助对肿瘤的诊断。第31页，共63页，星期日，2025年，2月5日质粒DNA的提取与定量

ExtractionandQuantitationofPlasmidDNA第32页，共63页，星期日，2025年，2月5日一、什么是质粒？独立于细菌染色体以外，能独立自主复制的闭合环状DNA分子；基因工程常采用的载体第33页，共63页，星期日，2025年，2月5日质粒提取方法方法：碱裂解法煮沸裂解羟基磷灰石柱层析法酸酚法等。概括起来主要是用非离子型或离子型去污剂、有机溶剂或碱进行处理及用加热处理选择哪一种方法主要取决于以下几个因素：质粒的大小大肠杆菌菌株裂解后用于纯化的技术和实验要求第34