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间接红细胞凝集试验诊断血吸虫病

间接红细胞凝集试验

（Indirecthaemagglutinationtest,IHA）以红细胞为载体1吸附预先制备的特异性抗原或抗体作为试剂2检测标本中的相应抗体或抗原3血清学方法4特点：抗原与其抗体之间的特异性反应红细胞凝集现象5

国外最早于1955年应用于检测马抗血清01国内陶义训等（1958）首先应用于诊断日本血吸虫病02杨赞元等（1976）应用冰冻干燥方法制备试剂03

01是指细菌、细胞等颗粒性抗原加入相应抗体，并在适量电解质存在的条件下，两者特异性结合且进一步凝聚成肉眼可见的小块。02凝集反应分为直接凝集和间接凝集反应。（一）凝集反应一、基本概念

日本血吸虫可溶性虫卵抗原绵羊、家兔、鸡的红细胞及O型人红细胞致敏的新鲜红细胞保存时间短，且易变脆、溶血和污染，只能使用2～3天致敏前将红细胞醛化，可长期保存而不溶血常用的醛类有甲醛、戊二醛、丙酮醛原理载体颗粒（二）间接红细胞凝集试验

IHA：用抗原致敏红细胞检测标本中抗体1反向间接血凝试验：用特异性抗体致敏红细胞检测标本中的相应抗原2间接血凝抑制试验3反向间接血凝抑制试验4（三）间接血凝的类型

（正向）间接凝集反应

反向间接凝集反应

间接凝集抑制反应

（一）血吸虫虫卵抗原制备分离虫卵→脱水、脱酯干燥→研磨成细粉→冻融→超声粉碎→普通离心→高速离心。经离心后的上清液，即为虫卵抗原原液，保存于-20℃中备用。二、冻干致敏红细胞的制备

AB敏感性高，特异性强，能区别不同感染度，能区别现在感染还是过去感染，价廉。A但目前还没有，今后可能依靠杂交瘤技术、DNA技术而获得理想的抗原。B理想抗原

取人“O”型血红细胞3份（不同个体）混合，用生理盐水洗涤。置冰浴内，将戊二醛溶液慢慢滴入红细胞悬液中，边加边摇，醛化1h。用1/10000的柳硫汞蒸馏水配成10%的红细胞悬液，置于4℃备用。红细胞醛化

延长红细胞的保存时间，在4℃可保存1年克服了个体差异，保证实验重复性避免操作过程中因振荡、低渗、冻融使红细胞破裂、溶血醛化红细胞优点

01取1/10000鞣酸溶液与等量2.5%红细胞悬液混匀，置于37℃中15min，并不断摇动。洗涤，去除多余的鞣酸。02红细胞鞣化

鞣化红细胞的优点鞣化后红细胞易吸附蛋白抗原。

取虫卵抗原原液1:100稀释，与2.5%的鞣化红细胞等量混合，置于37℃水浴中30min，并不断摇动，然后离心，洗涤，去除多余抗原。用含有5%蔗糖及1%正常兔血清（56℃灭活）的pH7.2PBS保护液，配成10%浓度的致敏红细胞悬液。致敏效果与抗原的活性及纯度有关。红细胞致敏12

将上述致敏红细胞悬液摇匀，分装于2ml安瓿内。每支0.4ml，立即放入-40℃冰箱冰冻，待全部分装完毕后，移入冰冻干燥机内，冰冻干燥约24h，干燥后封口，保存于4℃中备用。冰冻干燥具有高科技含量不是单纯干燥，在冰冻状态下使水分子升华，不使红细胞破裂，不影响抗原活性。致敏红细胞的冰冻干燥

操作步骤01取生理盐水2ml，加入装有冰冻干燥红细胞的安瓿中，配成2.0%的红细胞悬液，摇匀。在“V”型微量血凝反应板的第1孔中加生理盐水100μl,第2、3孔中各加25μl。02

第1孔中加待检血清25μl，混匀后吸出25μl加于第2孔中，在第2孔中混匀后，吸出25μl加于第3孔中，混匀后弃去25μl。此时第1、2、3孔中的血清稀释度依次为1:5、1:10、1:20。01在第2、第3孔中各加致敏红细胞悬液25μl，将反应板放在振荡器上振荡1min，室温下静置45min，观察反应结果。02

反应标准01阴性反应：红细胞全部下沉在凹底部，形成紧密的圆点，周围整齐清晰。阳性反应：待检者血清以1:10稀释度出现凝集反应为阳性起点01

反应强度“-”：红细胞全部下沉在凹底部，形成紧密的圆点，周围整齐清晰“+”：多数红细胞下沉在凹底部形成圆点，周围可见少量凝集红细胞“++”：凹底部可见明显的红点，凝集红细胞在底部形成小薄层

“+++”：凹底部可见很弱的红点，红细胞呈疏松的颗粒凝集“++++”：红细胞呈明显的颗粒凝集，均匀散布于凹底部周围形成薄层，有时呈皱褶状效价(滴度)：发生凝集现象最高的血清稀释度。

影响因素及注意事试剂：保存、对照、效价、摇匀。反应板：“V”型，底角应为90°。反复冲洗。毛细吸管：校正、垂直。血清样本：新鲜为宜，保存在冰盒内。溶血样本将影响测定结果的准确性。

生理盐水：用于稀释IHA试剂、阳参、阴参、血清样本的生理盐水必须保持无菌。判断反应结果：在判断反应结果时应在反应板下面衬一张白纸，使反应结果更加清晰。先观察空白对照、阴参、阳参，再观察样本。

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