第五章亲和层析分离技术.pptVIP

常见的核苷酸及辅酶亲和层析介质配基分类配基生产公司典型应用腺苷腺苷3’，5’－环化单磷酸（CAMP）PLBiochemicalSIGMA腺苷激酶及脱氨酸腺苷－3’，5’二磷酸（3’，5’－ADP）PLBiochemicalSIGMAPharmcia依赖辅酶A的酶腺苷－5’－单磷酸（AMP）PLBiochemical磷酸化酶腺苷－5’－三磷酸（AIP）PLBiochemical激酶辅酶辅酶A（CoA）PLBiochemicalCoA转移酶，乙酸-CoA酶氧化型辅酶I（NAD＋）PLBiochemicalSIGMA5-核苷酸酶氧化型辅酶Ⅱ（NADP＋）PLBiochemical核酸酶核苷酸鸟苷-5’-三磷酸SIGMA谷氨酸脱氢酶5.4.1核苷酸及辅酶亲和层析第30页，共45页，星期日，2025年，2月5日N6（6-氨己基）氨甲酰-AMP-Sepharose间接偶联法示意图核苷酸及辅酶亲和层析第31页，共45页，星期日，2025年，2月5日核苷酸及辅酶亲和层析核苷酸亲和层析的合成碳二亚胺直接法偶联间接偶联法核苷酸亲和层析的吸附和解吸第32页，共45页，星期日，2025年，2月5日第1页，共45页，星期日，2025年，2月5日亲和层析技术5.1简介5.2亲和层析理论5.3亲和层析介质活化5.4常见底亲和层析技术第2页，共45页，星期日，2025年，2月5日利用生物大分子之间的专一性识别性或特定的相互作用的分离技术称为亲和层析分离技术5.1简介第3页，共45页，星期日，2025年，2月5日简介——亲和配基单专一性的小分子配基基团专一性小分子亲和配基专一性的大分子亲和配基免疫亲和配基基因专一性的大分子亲和配基第4页，共45页，星期日，2025年，2月5日参数生物专一性（AC）拟生物专一性配基亲和层析IMACDLACHLAC专一性很高较高中等较高，取决于吸附条件配基交联技术很多环氧化物直接吸附或对氧化物解吸难易中等容易化学交联容易容易吸附容量低，0.1-1.0%配基利用高高中等再生及稳定性较差，易变性高高高，可用浓或处理成本高较低最低较低不同亲和层析分离方法的比较第5页，共45页，星期日，2025年，2月5日简介——亲和洗脱亲和洗脱是和亲和吸附（AffinityAdsorption）对应的，即利用在洗脱液中加入和吸附目标蛋白有专一性的物质，而只将目标分子解吸下来。亲和洗脱可用于亲和层吸，也可以用于普通的层析如离子交换等的解吸。亲和洗脱一般采用和目标分子具有识别性的小分子或类似物。第6页，共45页，星期日，2025年，2月5日亲和层析分离技术亲和层析的理论亲和介质的制备常见的亲和层析第7页，共45页，星期日，2025年，2月5日5.2亲和层析的理论当蛋白质在非凝胶相和凝胶相之间达到平衡第8页，共45页，星期日，2025年，2月5日亲和层析的理论对正常的凝胶过滤色谱而言亲和色谱中，固定配基在蛋白和凝胶之间产生的额外亲和作用第9页，共45页，星期日，2025年，2月5日亲和层析的理论第10页，共45页，星期日，2025年，2月5日实际上，Ve’/Ve很难测定，但在洗脱液中，加入可活性配基或竞争性抑制剂，使固定配基的表边的亲和力降低，其数值可以测得亲和层析的理论第11页，共45页，星期日，2025年，2月5日推导得到在可溶性亲和竞争性配基的存在下，固定配基对酶的阻滞作用降低，其程度取决于可溶性配基和固定配基的相对浓度和解离常数。亲和层析的理论第12页，共45页，星期日，2025年，2月5日5.3亲和介质的制备介质的选择介质的活化和偶联亲和配基固定偶联的密度的测定间臂分子的选择第13页，共45页，星期日，2025年，2月5日介质的选择通常而言，亲和色谱的介质应具备下面四个条件：具有多孔网络结构非特异吸附小，基质化学性质应是惰性，表面电荷尽可能低；理化性质稳定，不因共价偶联反应的条件及吸附条件的变化而发生变化；基质必须能够活化或功能化介质是亲和配基附着的基础，起着支撑和骨架作用第14页，共45页，星期日，2025年，2月5日介质的选择多糖类：纤维素（cellulose）、葡聚糖（dextrin）琼脂糖（agarose）聚丙烯酰胺无机基质可控制孔径多孔玻璃（CPG）