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第1页，共29页，星期日，2025年，2月5日1、检测外源基因在植物细胞中的转录，对外源基因表达调控进行研究，掌握引物的选择、cDNA的合成、RT-PCR检测的原理与方法。。实验目的第2页，共29页，星期日，2025年，2月5日第3页，共29页，星期日，2025年，2月5日第4页，共29页，星期日，2025年，2月5日第5页，共29页，星期日，2025年，2月5日第6页，共29页，星期日，2025年，2月5日第7页，共29页，星期日，2025年，2月5日第8页，共29页，星期日，2025年，2月5日第9页，共29页，星期日，2025年，2月5日第10页，共29页，星期日，2025年，2月5日第11页，共29页，星期日，2025年，2月5日第12页，共29页，星期日，2025年，2月5日第13页，共29页，星期日，2025年，2月5日第14页，共29页，星期日，2025年，2月5日第15页，共29页，星期日，2025年，2月5日1、材料：转基因植物的RNA或mRNA制备物。非转化的植株材料总RNA或mRNA制备物2、设备：PCR仪、移液器、PCR管等。3、试剂：10×RT缓冲液、dNTP、逆转录酶、引物（随机引物，OligodT;特异引物)、10×OneStepRNAPCRBuffer、25mMMgCl2、10mMdNTP、RNaseInhibitor(40U/μl)、AMV-OptimizedTaq1μl、AMVRTaseXL(5U/μl)、上游特异Primer(20μM)*1、下游特异Primer(20μM)*2、RNaseFreeH2O。实验材料、设备及试剂第16页，共29页，星期日，2025年，2月5日实验操作步骤：1）RNA提取：关键防止RNA降解RNA提取的成功与否是RT-PCR检测中最重要的步骤。第17页，共29页，星期日，2025年，2月5日2、cDNA第一链的合成：取1个0.2ml的PCR管，依次加入下列试剂：10×PCRBuffer1μlRNaseFreedH2O5.75μldNTP1μlRNaseInhibitor0.25μlAMVRTaseTranscriptase0.5μloligodT-Adaptorprimer0.5μlRNA1μlTotal10μl实验步骤第18页，共29页，星期日，2025年，2月5日反应条件：42℃30min99℃5min5℃5min第19页，共29页，星期日，2025年，2月5日3、PCR反应取一个0.2ml的PCR管，依次加入下列试剂：
10×PCRBuffer4μl
灭菌蒸馏水9μl
10mMdNTP２.5μl
Taq酶0.1μl
上游特异Primer(20μM)*10.2μl
下游特异Primer(20μM)*20.2μl
Total16μl
将（1）的反应结果稀释20倍，取10μl加入到（2）管中，轻轻摇匀。第20页，共29页，星期日，2025年，2月5日反应条件：94℃2min94℃30s55℃30s72℃1min72℃7min30Cycles第21页，共29页，星期日，2025年，2月5日
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