分子生物学实验课件.ppt

分子生物学实验室温下待凝胶完全凝固，需时约30分钟，揭去两端胶布，拔出梳齿，将胶板放入电泳槽中。在电泳槽中加入1×TAE缓冲液，以高出凝胶表面2mm为宜。将样品置震荡器上混匀，短暂离心。用加样器吸取样品。依次分别加入三个点样孔中，注意加样器吸头应恰好置于凝胶点样孔中，不可刺穿凝胶，也要防止将样品溢出孔外。接通电源，调节电压至50伏，电泳90分钟后，将凝胶板取出，在紫外灯下观察结果。分子生物学实验影响DAN片段琼脂糖电泳的几个因素：DNA分子的大小：线性DNA分子的迁移率与其分子量的对数值成反比。DNA分子的形态：在同一浓度的琼脂糖凝胶中，超螺旋DNA分子迁移率比线性DNA分子快，线性DNA分子比开环DNA分子快。琼脂糖浓度：一定大小的DNA片段在不同浓度的琼脂糖凝胶中的迁移率是不相同的。相反，在一定浓度的琼脂糖凝胶中，不同大小的DNA片段的迁移率也是不同的。若要有效地分离不同大小的DNA，应采用适当浓度的琼脂糖凝胶。电流强度：每厘米凝胶电压不超过5V，若电压过高分辨率会降低，只有在低电压时，线性DNA分子的电泳迁移率与所用电压成正比。琼脂糖凝胶浓度可分辨的线性DNA片段大小（kb）0.45~600.70.8~101.00.4~61.50.2~41.750.2~32.00.1~3琼脂糖凝胶浓度可分辨的线性DNA片段大小（kb）分子生物学实验PCR技术：1985年由美国Cetus公司的KaryMullis首创，可以将微量目的DNA片段扩增一百万倍以上。优点：敏感度高、特异性强、产率高、重复性好以及快速简便等，广泛应用于微生物学、考古学、法医学及体育等领域，并已普及到许多普通实验室，大大简化了传统的分子克隆技术，从而比较容易地对目的基因进行分析、鉴定。KaryMullis本人因此获1993年诺贝尔化学奖。聚合酶链式反应技术分子生物学实验DNA扩增的传统方法：一般采用分子克隆法，需将构建的含有目的基因的载体导入细胞进行扩增，并需要用探针进行筛选，牵扯到DNA酶切、连接、转化、培养及探针杂交等技术，虽然技术上已无难点，但操作复杂，需数周到数月的时间，且不利于普及。分子生物学实验一、PCR的原理：用于扩增位于两段已知序列之间的DNA片段，类似于天然DNA的复制过程。以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板5′末端和3′末端互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成，重复这一过程，即可使目的DNA片段得到扩增。分子生物学实验（一）PCR技术的基本过程扩增的特异性取决于引物与模板DNA的特异结合，基本反应步骤分三步：1.变性(Denaturation)：加热使模板DNA双链间的氢键断裂而形成两条单链。94℃30″2.退火(复性)(Annealling):突然降温后模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合，也存在两条模板链之间的结合，但由于引物的高浓度，结构简单的特点，主要的结合发生在模板与引物之间。55℃30″分子生物学实验3.延伸(Extension):将反应温度调节到酶的最适温度，在DNA聚合酶、4种dNTPs及镁离子等存在的条件下，以引物的3′端开始，结合单核苷酸，形成与模板链互补的新DNA链。72℃1′上述3步为一个循环，每经过一个循环，样本中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过25～40个循环后DNA可扩增106～109倍。分子生物学实验PCR的基本反应步骤变性95?C延伸72?C退火Tm-5?C分子生物学实验5?Primer15?Primer25?5?TemplateDNAPCR技术原理分子生物学实验Cycle325～30次循环后，模板DNA的含量可以扩大100万倍以上。分子生物学实验PCR扩增的特异性是由一对寡核苷酸引物所决定的。反应初期，原来的DNA担负起使模板的作用，随着循环次数的递增，由引物介导延伸的片段急剧增多而成为主要模板，最终的扩增产物是介于两种引物5’端之间的DNA片段。分子生物学实验分子生物学实验分子生物学实验分子生物学实验分子生物学实验分子生物学实验分子生物学实验分子生物学实验分子生物学实验分子生物学实验分子生物学实验分子生物学实验分子生物学实验分子生物学实验分子生物学实验分子生物学实验目的：掌握分子生物学基本技术，主要包括RNA提取、反转录、PC