分子生物学实验 第四章 目的基因的获取课件.ppt

分子生物学实验第四章反转录酶（3）cDNA的合成①cDNA第一链合成逆转录酶能以RNA为模板合成DNA。用OligodT（或随机引物）作引物，合成cDNA的第一链。mRNAcDNA3’5’5’AAAAAAATTTTTTTOligodT引物分子生物学实验第四章用碱处理或用RNaseH降解mRNA-DNA杂交分子中的mRNA。mRNAcDNA3’3’5’5’反转录酶引物mRNAcDNA第一链3’3’5’5’引物cDNA第一链3’5’引物②降解mRNA模板或RNaseH碱分子生物学实验第四章剩下的cDNA单链的3’末端一般形成一个弯回来的双链发卡结构（机理不明），可成为合成第二条cDNA链的引物。用DNA聚合酶合成第二链DNA.。cDNA第一链5’cDNA第二链合成DNA聚合酶cDNA第一链cDNA第二链5’3’③cDNA第二链合成分子生物学实验第四章④去掉发卡结构核酸酶S1用核酸酶S1可以切掉发卡结构（但这会导致cDNA中有用的序列被切掉！）。cDNA第一链cDNA第二链5’3’cDNA第一链cDNA第二链5’3’5’3’分子生物学实验第四章分子生物学实验第四章这种酶能识别mRNA-cDNA杂交分子中的mRNA，并将其降解成许多小片断。妙用RNaseH小片断正好成为DNA聚合酶的引物，用来合成冈崎片断。DNAPolI除去引物并修补后再使用DNA连接酶连成一整条DNA链。分子生物学实验第四章mRNAcDNA3’5’反转录酶引物mRNAcDNA第一链3’5’引物mRNAcDNA第一链3’5’mRNAmRNADNA聚合酶DNA聚合酶cDNA第二链cDNA第一链3’5’RNaseHDNAligase去引物分子生物学实验第四章分子生物学实验第四章在双链cDNA末端接上人工接头，即可与载体连接，转入受体菌。或借助末端转移酶给载体和双链cDNA的3’端分别加上几个C或G，成为粘性末端。5.cDNA与载体连接：接上人工接头粘性末端CCCCCC末端转移酶分子生物学实验第四章分子生物学实验第四章6.cDNA文库的大小一个cDNA文库要包含99%的mRNA时所需要的克隆数目。N=ln(1-p)ln(1-)p:文库包含了完整mRNA的概率（99%）:某一种低丰度（不足14份拷贝）mRNA占细胞整个mRNA的比例N：所需的重组载体数（克隆数）1n1n分子生物学实验第四章三、文库的查询（screening）用目的基因探针与文库中的重组载体进行Southernblot杂交。文库载体探针电泳后杂交放射自显影测序分析分子生物学实验第四章第四节目的基因的分离和扩增一、目的基因的分离1.探针柱分离特异mRNA根据已知的基因序列合成探针，结合到纤维素柱上，用来分离纯化该基因的mRNA。富集特定基因的mRNA或cDNA模板。分子生物学实验第四章第四章目的基因的获取目的基因：准备要分离、改造、扩增或表达的基因。分子生物学实验第四章第一节基因组DNA片断化一、限制性内切酶法用限制性内切酶把基因组DNA切成不同大小的片断。酶切分子生物学实验第四章由于带有粘性末端，产物可以直接与载体连接。1.优点2.缺点目的基因内部也可能有该内切酶的切点。目的基因也被切成碎片！BamHIBamHIBamHIgene分子生物学实验第四章二、随机片断化1.限制性内切酶局部消化法控制内切酶的用量和消化时间，使基因组中的酶切位点只有一部分被随机切开。①内切酶识别位点的碱基数影响所切出的产物的长度和随机程度。（1）限制性内切酶的选用原则分子生物学实验第四章1）4bp的内切酶平均每46（4096）bp一个切点。2）6bp的内切酶平均每44（256）bp一个切点。随机程度高。如HaeⅢ、AluI、Sau3A。②内切酶粘性末端能与常用克隆位点相连。（Sau3A—BamHI）分子生物学实验第四章2.机械切割法（1）超声波超声波强烈作用于DNA，可使其断裂成约300bp的随机片断。（2）高速搅拌1500转/分下搅拌30min，可产生约8kb的随机片断。分子生物学实验第四章1976年H.G.Khorana提出了用化学方法合成基因的设想，并于1979年在science上发表了率先成功地合