分子生物学 研究方法-上课件.ppt

分子生物学研究方法-上dsDNA变性→与1条标记引物退火→在4个反应管中分别加入dNTP和1种双脱氧核苷酸→DNA聚合反应→反应产物变性电泳→凝胶干燥→放射自显影→序列读取。（2）步骤双脱氧核苷酸链终止法测序示意图分子生物学研究方法-上分子生物学研究方法-上DNAsequencinggelshowingtheseparationoffragmentsinthefoursequencingreactions(oneperlane).分子生物学研究方法-上分子生物学研究方法-上思考题：假定某一基因克隆的部分序列为5ˊ—TCACGTAAGT—3ˊ，试根据Sanger序列分析方法原理画出测定上述序列的放射自显影示意图，并对示意图作必要的标注和解释。分子生物学研究方法-上1.5.2DNA序列测定的自动化使用自动测序仪,使得模板制备自动化、定序反应自动化、凝胶电泳自动化、核苷酸序列阅读与计算机输入自动化。分子生物学研究方法-上DNA序列分析自动化包括两个方面的内容:一是指“分析反应”的自动化;另一方面则是指“读片过程”的自动化。优点：i.四个反应系统可合并点样，大大节省制胶和点样时间。ii.可同时读出多个样品核苷酸序列，不需干燥凝胶和放射自显影。iii.可连续电泳，可读出较多的核苷酸序列。缺点：无法保留原始记录,四个反应产物点在一条道上,相互间会发生干扰,导致读序时分辨率下降。DNA序列测定的自动化分子生物学研究方法-上荧光素标记核苷酸—应用举例分子生物学研究方法-上InDNAsequencingusingdideoxynucleotideslabeledwithfluorescentdyes,allfourddNTPsareaddedtothesametube,andduringprimerextension,allcombinationsofchainsareproduced.分子生物学研究方法-上分子生物学研究方法-上AutomatedDNAsequencingusingfluorescentdyes,oneforeachbase分子生物学研究方法-上1.6基因文库的建立克隆（clone）：作名词用，是指具有相同DNA分子的一个群体或基因型相同的一个生物群体。作动词用，指“进行克隆”或“去克隆”，将一特定DNA顺序插入一个载体分子。亚克隆（次克隆，二级克隆，sub-clone）：是指从已经克隆在载体中的一个大片段中取出较小的DNA片段再进行克隆的方法。基因文库(genelibrary):包括基因组文库和cDNA文库。YAC和BAC文库分子生物学研究方法-上基因工程基本操作步骤：“分、切、连、转、筛”基因组文库的构建步骤分子生物学研究方法-上1.6.1基因组文库基因组文库:含有某种生物全部遗传信息的重组DNA分子的克隆总体。基因组文库的规模：N=ln（1–p）/ln（1-f）上式中，N：克隆数；p：某DNA片段在基因文库中出现的概率；f：插入片段的平均大小与基因组大小的比值。分子生物学研究方法-上1.6.2cDNA文库从一定生长阶段的某种细胞或组织分离得到的总mRNA反转录成总cDNA，插入到克隆载体，然后再将cDNA重组子转移到宿主细胞中进行增殖。通过上述方法所获得的无性繁殖系即为cDNA文库。cDNA文库构建步骤分子生物学研究方法-上与cDNA克隆或文库构建有关的几个问题cDNA的概念：第一链cDNA；cDNA基因；cDNA编码序列。mRNA质量的检测：根据甲醛变性胶电泳的rRNA的带型进行判定。mRNA的纯化：0ligo（dT）-纤维素柱层析；抗生物素蛋白磁珠吸附法。[生物素标记0ligo（dT）]。cDNA重组子的形成：在cDNA双链末端或添加同聚物单链尾巴，或添加含适当限制酶识别序列的“接头”（linker），以便与适当载体重组。分子生物学研究方法-上Trametesgallica总RNA的甲醛变性电泳mRNA质量的检测分子生物学研究方法-上（1）Southern杂交（Southern印迹）：用适当的限制酶消化待测DNA，电泳后，将凝胶浸于碱性溶液中以变性DNA，再经毛细作用将变性的DNA从凝胶中转移至杂交膜上并固定，然后与放射性同位素标记的核酸探针杂交，再经放射自显影显示杂交结果。该技术可有效地分析基因结构或检测待测DNA样本中是否