2025届高三生物学二轮复习课件：CRISPRCas9基因编辑与单酶切导致的正、反接的电泳检测和PCR检测.pptxVIP

;;(2021·海南卷，25)CRISPR/Cas9是一种高效的基因编辑技术，Cas9基因表达的Cas9蛋白像一把“分子剪刀”，在单链向导RNA(sgRNA)引导下，切割DNA双链以敲除目标基因或插入新的基因。CRISPR/Cas9基因编辑技术的工作原理如图所示。;回答下列问题。

(1)过程①中，为构建CRISPR/Cas9重组质粒，需对含有特定sgRNA编码序列的DNA进行酶切处理，然后将其插入到经相同酶切处理过的质粒上，插入时所需要的酶是____________。;(3)过程③～⑤中，sgRNA与Cas9蛋白形成复合体，该复合体中的sgRNA可识别并与目标DNA序列特异性结合，二者结合所遵循的原则是__________________。随后，Cas9蛋白可切割________________________序列。;(5)某种蛋白酶可高效降解羽毛中的角蛋白。科研人员将该蛋白酶基因插入到CRISPR/Cas9质粒中获得重组质粒，随后将其导入到大肠杆菌细胞，通过基因编辑把该蛋白酶基因插入到基因组DNA中，构建得到能大量分泌该蛋白酶的工程菌。据图简述CRISPR/Cas9重组质粒在受体细胞内，将该蛋白酶基因插入到基因组DNA的编辑过程：;CRISPR/Cas9是细菌体内的用来对抗侵略细菌的外源DNA或噬菌体的基因编辑系统。CRISPR是成簇的、规律间隔的、短回文重复DNA序列。Cas9蛋白是一种RNA引导的DNA内切核酸酶，当细菌受到噬菌体的侵染时，它的某段DNA序列被Cas内切酶剪切后整合到CRISPR的间隔序列区域，当相同种类的噬菌体再次侵染细菌时，转录的crRNA可以引导Cas9蛋白找到并切断噬菌体(形成平末端)释放到细菌体内的DNA，从而阻止噬菌体在细菌体内繁殖。其作用机制大体可以分为三个步骤：

(1)Cas内切酶(Cas酶)切割噬菌体获取新的间隔序列。

(2)将其引入原间隔序列并转录出crRNA。;(3)crRNA和Cas9蛋白形成复合物精准切割与新间隔序列相同的基因。具体过程如图所示。;命题要点提醒：

(1)质粒构建：在一个载体上包含目标DNA片段的特定区域和Cas9内切核酸酶基因。

(2)基因编辑用途：定点基因编辑，构建一个质粒即可，基因(部分)切除，需要构建两个质粒，两个质粒转录出的sgRNA分别与基因的两侧碱基配对。

(3)脱靶问题：即对基因组非特异性切割。有效解决方法：适当增加sgRNA的长度，设计出特异性较强的sgRNA。;(2024·九省联考广西卷，21)PCR可用于扩增并检测DNA，但存在交叉污染或偏差等问题，而新研发的基于CRISPR/Cas12a系统的检测方法，可在低浓度样本中更灵敏，快速识别靶标DNA。该系统利用gRNA介导Cas12a蛋白能准确切割靶标DNA。同时切割荧光底物使其发出荧光，通过检测荧光强度确定靶标DNA含量，利用Cas12a检测靶标DNA的过程如图所示。回答：;(1)根据图中信息可推测Cas12a作用于靶标DNA时，具有类似_______酶和______酶的功能；gRNA识别靶标DNA，遵循的是__________________原则。

(2)在构建表达Cas12a蛋白的载体时，通常是将Cas12a基因插入到LacZ基因内，使LacZ基因失活，从而失去催化无色底物显色的能力，AmpR为氨苄青霉素抗性基因。理论上通过含氨苄青霉素且不含无色底物的对应培养基培养，不能筛选到含有Cas12a基因表达载体的工程菌，判断的依据是___________________________________________

______________________________________________________________________________________。;(3)荧光检测时，60分钟后三组荧光信号强度达到一致，原因是______________________________

_________________________。

(4)实验研究时，增加NTC组作对照的作用是_______________________________________________________；g－3＋g－7组可更快检测出靶标DNA，原因是___________________________

___________________________________________________。;

;A;1.利用单酶切法和双酶切法构建基因表达载体;关于同尾酶及切割连接

不同种限制性内切核酸酶识别序列各不相同，但切割后能产生相同的黏性末端，则称为同尾酶。如BamHⅠ、BclⅠ、BglⅡ、Sau3AⅠ、XhoⅡ为一组同尾酶，它们的识别序列和切割位点依次分别是5′－G↓G