DB13T 1115-2009 食品中军团菌的测定.docxVIP

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河

北

省

地

DB13

方标准

DB13/T1115—2009

食品中军团菌的测定

DeterminationofLegionellabacteriainfood

2009-05-27发布2009-06-11实施

河北省质量技术监督局发布

I

DB13/T1115—2009

前言

本标准参照ISO11731-1998《军团菌的检测方法(英文版)》制定。本标准由河北省质量技术监督局提出并归口。

本标准起草单位：河北省食品安全重点实验室、河北省食品质量监督检验研究院。本标准主要起草人：周正、张岩、周巍、刘辰魁、康素芬、刘东、穆燕魁。

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DB13/T1115—2009

食品中军团菌的检测方法

1范围

本标准规定了食品中军团菌的检验方法。该方法适用于饮用水中军团菌的检验。

2术语和定义

下列术语和定义适用于本标准。3.1

军团菌Legionella

杆形菌，宽度0.3~0.9μm,长度为2~20μm以上，不形成内孢子或小囊，无荚膜，不产酸，革兰氏染色阴性，借一两根或以上直的或弯曲的极鞭毛和侧鞭毛可以运动，偶尔可见无动力菌株。需氧，生长时需L-半胱氨酸和铁盐。氧化酶阴性或弱阳性，硝酸盐还原试验阴性，尿素酶阴性，液化明胶。细胞壁中有支链脂肪酸。可从有机化合物中摄取营养，可利用氨基酸作为能量来源。不发酵碳水化合物，亦不能使之氧化。可从地表水、泥土和热水及污染的湖水和河水中分离到本菌，但从土壤和动物中分离尚不了解，对人有致病性，DNA的G+Cmol%含量为39~43%(TmBd)。

3试剂

3.1缓冲木炭酵母膏琼脂培养基(BCYE)。

3.2无L-半胱氨酸缓冲木炭酵母膏培养基(BCYE-Cys)。

3.3选择性缓冲木炭酵母膏培养基(GVPC)。

4仪器

4.1恒温培养箱：36℃±1℃。

4.2天平：感量0.1g。

4.3无菌吸头。

4.4无菌试管。

4.5无菌锥形瓶。

5操作步骤

5.1总则：如果液体样品军团菌的数量估计超过10?,可以采用直接平板法。为了确保低于这个数量样品中军团菌的检测，需采用浓缩技术。为了浓缩水样，可采用膜过滤法(5.2)或离心法(5.3)。

5.2膜过滤法：如果样品是浑浊的、乳浊的或有颜色的，应采用离心法。采用膜过滤装置进行膜过滤，采用直径47～147mm,孔径0.22μm和0.45μm的膜。过滤后的膜应放置在带盖的无菌容器中，可用无菌剪刀剪碎，加5mL~25mL的无菌稀释液或无菌去离子水，不断摇动至少2min。也可将容器放入超声波中2～10min。

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5.3离心法：取200mL样品于300mL~500mL容积的离心瓶中，6000g离心10min或3000g离心30min,保持温度在15℃~25℃,弃去上清液，将沉淀物悬浮在2mL~20mL无菌稀释液或无菌去离子水中。

5.4培养

5.4.1将制备好的样品(浓缩的或未浓缩的)分成3份，1份不做任何处理；1份进行热处理；1份进行酸处理。

5.4.2热处理：加1mL±0.5mL样品于一无菌容器中，50℃±1℃水浴处理30min±2min。

5.4.3酸处理：加1mL~10mL样品于一拧盖的容器中，6000g离心10min或3000g离心30min,用无菌枪头吸去一半体积的上清液，通过涡旋重新悬浮剩余物，用酸处理缓冲液补足原始体积。混合静置5min±0.5min。

5.4.4选择性培养基的接种：分别接种未处理、热处理和酸处理的样品0.1mL~0.5ml于GVPC培养基上，热处理和酸处理的样品应在处理完立即接种，记录接种体积。

5.4.5培养：翻转平板，36℃±1℃培养10d。

5.4.6检查平板

在10d的培养期间，用显微镜在2d~4d内至少观察3次(军团菌生长较慢，很可能被其他菌掩盖),记录每一种菌落形态的数量。

6可疑军团菌的确证

从每个GVPC平板上至少选择3个可疑军团菌菌落接种到BCYE和BCYE-Cys两块平板上进行二次培养，36℃±1℃培养至少2d。在BCYE上生长而在BCYE-Cys上不生长的被认为是军团菌。通过血清学实验确证在BCYE上生长而在BCYE-Cys上不生长的菌落。

注：血琼脂和营养琼脂可以代替BCYE-Cys培养基