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T4DNA连接酶用途：1）互补粘性末端的连接;2）平头末端的相连；3）一条带有切口的双链DNA分子；4）DNA杂合体中ＲＮＡ链上的切口。E.coliDNA连接酶用途：1)互补粘性末端的连接;2)一条带有切口的双链DNA分子。第31页，共76页，星期日，2025年，2月5日（1）由ATP（或NAD+）提供AMP，形成酶-AMP复合物，同时释放出PPi或NMN；（3）连接机理（2）激活的AMP结合在DNA链5’端的磷酸基团上，产生含高能磷酸键的焦磷酸酯键；（3）与相邻DNA链3’羟基相连，形成磷酸二酯键，并释放出AMP。第32页，共76页，星期日，2025年，2月5日（4）不同末端连接策略①单酶切产生的相同黏性末端第33页，共76页，星期日，2025年，2月5日②双酶切产生的黏性末端第34页，共76页，星期日，2025年，2月5日③双酶切产生不同的5?突出末端第35页，共76页，星期日，2025年，2月5日④双酶切产生不同的3?突出末端第36页，共76页，星期日，2025年，2月5日⑤双酶切产生的5?突出末端和3?突出末端第37页，共76页，星期日，2025年，2月5日⑥平切产生的平末端第38页，共76页，星期日，2025年，2月5日平末端DNA片段的连接操作从分子动力学的角度讲，由限制性核酸内切酶创造的粘性末端的连接属于分子内部的连接，而平末端的连接则属于分子间的连接，因此后者反应速度要慢得多提高平末端连接效率的方法包括：加大连接酶用量（10倍大于粘性末端的连接）加大平头末端底物的浓度，增加分子间碰撞机会加入10%PEG8000，促进大分子之间的有效作用加入单价阳离子（NaCl），最终浓度150-200mM第39页，共76页，星期日，2025年，2月5日常用的平末端DNA片段连接法，主要有同聚物加尾法、衔接物连接法及接头连接法同聚物加尾法第40页，共76页，星期日，2025年，2月5日衔接物连接法衔接物（linker），是指用化学方法合成的一段由10～12个核苷酸组成、具有一个或数个限制酶识别位点的平末端的双链寡核苷酸短片段。第41页，共76页，星期日，2025年，2月5日DNA接头，是一类人工合成的一头具某种限制酶粘性末端另一头为平末端的特殊的双链寡核苷酸短片段。第42页，共76页，星期日，2025年，2月5日Tris-HCl50-100mMpH7.5MgCl210mMATP0.5-1mMDTT5mMVolume10-20μlTep.andTime4-15℃,4-16hr1UDNA连接酶的酶活性：在最佳反应条件下15℃反应1小时，完全连接1μgλDNA（HindIII片段）所需的酶量（5）DNA连接酶的反应条件第43页，共76页，星期日，2025年，2月5日增加插入片段与载体的接触机会，减少载体自我连接的现象。插入片段与载体的浓度比例反应温度插入片段浓度高，至少2︰1。一般14~16℃（6）影响DNA连接反应的因素平末端DNA分子的连接最适反应的酶量为1~2个单位，粘末端的连接，酶量为0.1个单位较好。DNA连接酶用法与用量第44页，共76页，星期日，2025年，2月5日4、DNA聚合酶（ligase）（1）DNA聚合酶的概念和类型DNA聚合酶：指在DNA(或RNA)模板指导下，以4种脱氧核糖核苷酸（dNTP）为底物，在引物3’-OH末端聚合DNA链的一类酶。DNA聚合酶的类型根据DNA聚合酶所使用的模板不同，将其分为两类：（1）依赖于DNA的DNA聚合酶；（2）依赖于RNA的DNA聚合酶。第45页，共76页，星期日，2025年，2月5日大肠杆菌DNA聚合酶Klenowfragment(克列诺酶)T7DNA聚合酶T4DNA聚合酶修饰过的T7DNA聚合酶逆转录酶（2）常见DNA聚合酶及共有特点第46页，共76页，星期日，2025年，2月5日以脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)为前体催化合成DNA;需要模板和引物的存在;不能起始合成新的DNA链;催化dNTP加到生长中的DNA链的3-OH末端;催化DNA合成的方向是5→3。共同特点主要区别持续合成能力和外切酶活性不同。T7DNA聚合酶可以连续添加数千个dNTPs而不从模板上掉下来。其它几种DNA聚合酶只能连续添加10多个dNTPs就会从模板上解离下来。第47页，共76页，星期日，2025年，2月5日DNA聚合酶3