血红蛋白的提取和分离(经典).pptVIP

(一〕蛋白质;4、根本组成单位;氨基酸的结合方式;;;;;8、分子结构;10、生理功能;①氨基酸间脱水缩合时，原来的氨基和羧基就不存在了，形成的化合物即多肽的一端只有一个氨基，另一端只有一个羧基〔不计R基上的氨基和羧基〕。所以对于一条多肽链说，至少应有的氨基和羧基都是一个;③蛋白质可以含有一条或n条肽链、肽链通过化学键〔如二硫键〕互相连接，具有不同的空间结构;④关于蛋白质相对分子量的计算：n个氨基酸形成m条肽链，每个氨基酸的平均相对质量为a,那么由此形成的蛋白质的相对分子量为______________;血红蛋白;

思考1高温灭菌和酒精灭菌分别利用蛋白质

的何种作用，作用结果是什么被破坏？;本课题学习目标;

;原理：;4.凝胶色谱法别离蛋白质的原理和具体过程;凝胶色谱法别离蛋白质过程的动画演示

;二、缓冲溶液;三、电泳---血红蛋白的别离鉴定方法;最常用的电泳支持介质是聚丙烯酰胺和琼脂糖凝胶。琼脂糖有一个相对较大的孔径，用来别离大分子例如核酸、大蛋白和蛋白复合物，聚丙烯酰胺形成孔径较小的胶，适合于别离大多数蛋白和小片段核酸。

;;;

;聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳示意图

〔A为正面，B为剖面〕

1：样品胶pH6.72：浓缩胶pH6.7

3：别离胶pH8.94：电极缓冲液pH8.3;①琼脂糖凝胶电泳操作简单，电泳速度快，样品不需要事先处理；电泳后区带易染色，样品极易洗脱，便于定量测定。

②测定蛋白质的相对分子质量常用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，这是因为该方法别离蛋白质完全取决于分子的大小，而非所带电荷的性质和分子的大小、形状。;【典例1】有关凝胶色谱法和电泳法的说法正确的选项是

A.它们都是别离蛋白质的重要方法

B.它们的原理相同

C.使用凝胶色谱法需要使用缓冲溶液而电泳不需要

D.以上说法都正确

【解题关键】解答此题的关键应明确以下两点：

(1)凝胶色谱法的原理；

(2)电泳法的原理。;二、实验步骤;实验操作;血液;血红蛋白;采集得到血液〔参加抗凝血剂柠檬酸钠〕;

〔1〕红细胞的洗涤

A、洗涤目的:

B、别离时采用离心，用洗涤，重复洗涤，直至

C、能否用蒸馏水代替生理盐水？;初次离心后的结果;〔2〕释放血红蛋白;磁力搅拌器;搅拌器转子;搅拌器正在工作;〔3〕别离血红蛋白溶液：

;甲苯层〔无色透明〕;柜式离心机;2.粗别离----透析〔去除分子量较小的杂质〕;;透析过程动画演示;〔1〕凝胶色谱柱的制作;凝胶色谱柱的制作

;〔2〕凝胶色谱柱的装填;教材P70：为什么凝胶的装填要紧密、均匀？;装配好的凝胶柱;(3〕样品参加与洗脱;注意：正确的加样操作是：1、不要触及并破坏凝胶面。2、贴壁加样。3、使吸管管口沿管壁环绕移动。;

;;3.样品的参加和洗脱;①调整缓冲液面：与凝胶面平齐

②滴加透析样品：加到色谱柱的〔〕

③样品渗入凝胶床：〔〕

④再调整缓冲液面洗脱：

⑤收集：待〔〕接近色谱柱底端时收集;4、纯度鉴定〔电泳〕SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳

判断纯化的蛋白质是否到达要求，需要进行蛋白质的鉴定。

1、垂直板电泳装置

2、稳流稳压电泳仪；

3、微量进样器〔可用微量移液器代替〕;〔1〕、胶板的制备：

①.将玻璃板用蒸馏水洗净晾干

②.把玻璃板在灌胶支架上固定好;

〔2〕、别离胶的制备：

;〔3〕、浓缩胶的制备：;〔4〕、取样

取纯化后的血红蛋白样品10μL参加10μL上样buffer〔内含少许溴酚蓝的40％蔗糖〕混匀。;〔5〕装槽、点样：;;〔6〕电泳：;〔7)、剥胶、染色及脱色

凝胶板剥离：电泳结束后，撬开玻璃板，将凝胶板做好标记后放在大培养皿内，加染色液染色，然后用脱色液脱色。;(8)、结果;1、由于制备凝胶的丙烯酰胺和双丙烯酰胺具有很强的神经毒性，并且容易被皮肤吸收，因此操作必须在通风橱内或通风处进行。

2、TEMED和过硫酸胺对黏膜和上呼吸道组织、眼睛、皮肤等有很大的破坏作用，吞服可致命。

3、在进行电泳操作时一定按照实验要求和步骤完成。操作时要戴好一次性手套。;影响蛋白质分子运动速度的因素;思考下面的问题：;【典例2】(2011·扬州高二检测)如图表示血红蛋白提取和别离的局部实验装置，请答复以下问题：;(1)血红蛋白是人和其他脊椎动物红细胞的主要组成成分，其在红细胞中的作用表达了蛋白质具有____________功能。

(2)甲装置中，B是血红蛋白溶液，那么A