分子杂交与印迹.pptxVIP

第三章分子杂交与印迹技术

第一节核酸分子杂交的基本原理变性与复性变性定义：在一定的条件下，双螺旋之间氢键断裂，双螺旋解开，形成无规则线团，双链解链成为单链。

2、变性的方法：热变性：温度升高到90~100℃时，双链核酸分子链间的氢键完全断裂。酸碱变性：pH值低于3或高于10时，双链核酸分子链间的氢键断裂。化学试剂变性：如尿素、甲酰胺、甲醛等使双链核酸分子链间的氢键断裂。

紫外吸收值增加密度增加粘度降低变性后的理化性质变化：添加标题添加标题添加标题添加标题

DNA变性曲线AT区先解链GC区后解链阶梯式曲线

融解温度：定义：在DNA热变性时，其A260的升高达最大值一半时的温度。GC含量与Tm值之间的关系（G+C）%=（Tm-69.3)×2.44Tm=(G+C)%×0.41+69.3

（二）复性定义：变性的单链核酸分子在一定条件下按碱基互补原则重新结合为双链核酸的过程，称复性或杂交。具有互补序列的两条单链核酸都可互补形成双链：DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA、寡核苷酸/DNA和寡核苷酸/RNA。

2、复性过程单链分子间碰撞形成局部双链局部双链周围的碱基如不配对时，双链重新解离局部双链周围的碱基如配对，则形成中心序列形成完整的双链分子

3、复性的速率方程（服从二级反应动力学）dCdt=K2C2（1）将（1）积分CCo11+K2Cot=（2）一半单链DNA分子复性时，（2）式中的为121211+K2Cot=Cot1/2值越大，复性速度越慢CCo（3）1K2Cot1/2=

二、分子杂交将任何具有互补核苷酸顺序的两条单链核酸分子放入同一个反应体系，两条互补链可通过复性重新缔合形成双链，这一过程成为核酸分子杂交。

（一）探针的种类基因组DNA探针cDNA探针RNA探针寡核苷酸探针探针：是指带有标记物的、能与被检测的核酸片段互补的一段已知核酸片段。探针

（二）探针的制备方法DNA重组技术22%化学合成40%PCR扩增38%制备方法：

合成寡核苷酸探针注意原则长度（50-300bp);G:C对含量40%-60%；探针内避免互补；避免同一碱基连续出现；与非靶序列有70%以上同源性或连续8个以上碱基序列相同，最好不用。

（三）标记物1.想标记物应具备的特性：高度灵敏性不影响碱基配对的特异性不影响探针分子的主要理化性质对酶促反应活性无影响或影响不大检测方法具有高度灵敏性和高度特异性

标记物种类核素标记物：32p、35s、3H非核素标记物半抗原：生物素、地高率配体：生物素是亲和素的配体荧光素：异硫氰酸荧光素、罗丹明等化学发光探针：标记物与某种底物反应发光，如生物素酰化的碱性磷酸酶可使发光底物发光

（四）标记方法体内标记法：将核素标记的化合物作为合成代谢的底物，在细胞合成代谢时使核素掺入到新合成的核酸分子中，如3H-胸苷可掺入到DNA中，3H-尿苷可掺入到RNA中

体外标记法：#2022

酶促标记法1.切口平移法（nicktranslation)利用DNaseI在DNA双链上造成单链切口利用大肠杆菌DNA聚合酶I的5??3?核酸外切酶活性在切口处将旧链从5?末端逐步切除在DNA聚合酶I的5??3?聚合酶催化下，以互补的DNA单链为模板依次将dNTP连接到切口的3?末端-OH上，合成新的DNA链，同时将标记的核苷酸掺入到新的DNA链中010203

2.随机引物法其原理是随机引物能与各种单链DNA模板结合，作为合成新链的引物，在DNA聚合酶的催化下，按5??3?方向合成一新的DNA链，其核苷酸序列与模板DNA完全互补。另一单链DNA模板同样合成一条新的完全互补的DNA链。合成时，带放射性核素标记的核苷酸掺入到新合成的DNA分子中

随机引物法所具有的优点：能进行双链DNA、单链DNA或RNA探针的标记操作简单方便，避免因DNaseI处理浓度掌握不当所带来的一系列问题标记活性高，标记活性可达108cpm/μgDNA以上可直接在低熔点琼脂糖溶液中进行标记

PCR标记法：将标记的核苷酸作为PCR反应的底物，以待标记的DNA为模板，经PCR反应，标记的核苷酸掺入到新合成的DNA分子中

三、影响杂交的因素探针分子的浓度和长度：浓度越大，复性速度越快分子越大，复性速度越慢单链探针，浓度增加，杂交效率增加双链探针，浓度控制在0.1~0.5μg,浓度过高影响杂交效率

2、温度：DNA/DNA杂交，适宜温度较Tm值低20~25℃RNA/DNA或RNA/RNA杂交，加甲酰胺降低Tm值用寡核苷酸探针杂交，适宜温度较Tm值低5℃

3、离子强度：低盐浓度时杂交率较低，随着盐浓度增加，杂交率增加高浓度的盐使碱基错配的杂交体更稳定，当进行序列不完全同源的核酸分子杂