DB53_T939-2019_家畜体细胞系建立与冷冻保存_云南省.docxVIP

ICS65.020.30

B40

云南省地方标准

DB53/T939—2019

家畜体细胞系建立与冷冻保存

2019-12-23实施

发布

云南省市场监督管理局

DB53/T939—2019

前言

本标准按照GB/T1.1—2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》给出的规则起草。

本标准由云南省农业厅提出。

本标准由云南省农业标准化技术委员会（YNTC07）归口。

本标准起草单位：云南省畜牧兽医科学院。

本标准主要起草人：洪琼花、吕春荣、权国波、邵庆勇、吴国权、欧阳依娜、杨红远。

I

DB53/T939—2019

家畜体细胞系建立与冷冻保存

1范围

本规程规定了家畜体细胞系建立、冷冻保存方法、细胞系命名。

本规程适用于猪、牛、羊、马等家畜体细胞系建立、冷冻保存与细胞系命名。

2术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

2.1

2.2

原代培养

是指直接从家畜组织或器官，将其分散成细胞后开始的培养。

细胞系

无钙、镁的磷酸缓冲盐溶液，含有4.00mML-谷氨酰胺，4500mg/L葡萄糖的高糖DMEM，胎牛血清，

1%双抗，蛋白酶－乙二胺四乙酸：0.25%胰蛋白酶和0.02%乙二胺四乙酸（EDTA），二甲基亚砜（DMSO）。

高糖DMEM，10%～15%胎牛血清，1%双抗。

4.3样品采集、保存与运输

4.3.1采样个体选择

采集耳缘组织按以下步骤进行：

1

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a)先刮净采样部位耳毛，再用碘酒、75%的酒精消毒。

b)用消毒过的采样工具采取样品。

c)样品放入5mL～10mL备有培养基的离心管中，并封口。

d)标记样品名称、性别、年龄、采样地点、采样部位、个体编号及采样时间等信息，记录表参见

附录A中表A.1。

4.3.3样品保存与运输

样品放入4℃的采样箱后应于48h内带回实验室进行原代培养。

4.4细胞培养

4.4.1培养条件

在5%CO2、饱和湿度、37.0℃培养箱中进行培养。培养液变黄时应更换培养液，再继续培养。

4.4.2原代培养

原代培养按以下步骤进行：

a)无菌耳缘组织在75%的酒精中浸泡1min～2min，用含1%双抗的PBS反复洗涤3次，每次5min。

b)用眼科剪剪成1mm左右的碎块，置于培养瓶（皿）中进行组织块贴壁培养。

3

c)用消毒过的采样工具采取样品。

d)组织贴壁稳定后，加入培养液继续培养。

4.4.3传代培养

a)待细胞增殖至培养瓶（皿）底壁的80%～85%时，弃除培养液，添加细胞消化液在37.0℃消化

3min～5min。

b)显微镜观察，成纤维细胞由梭形变为圆形时立即添加培养液终止消化，制成细胞悬液。

c)将细胞悬液移至离心管中，经1000g/min离心5min后弃上清，加入PBS于相同条件下离

心清洗后，用培养液重悬细胞，用血球计数板或细胞计数仪计数细胞，调整细胞密度在1.0×

105个/mL对细胞进行传代培养。

细胞复苏

2

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a)从液氮中取出细胞冻存管，放入40℃水浴中不断摇动1min取出，用70%酒精消毒冻存管。

b)吸出细胞悬液，放入离心管中，加入10倍体积的细胞培养液，混合后1000g/min离心5min，

弃上清，再重复清洗一次。

c)对复苏后的细胞进行接种，接种密度以5×105/mL为宜。

6细胞系的命名

细胞系命名采用6级命名法，按以下步骤进行：

a)中文名由采样的物种、品种、性别、采样组织、细胞系编号、培养代数组成。

b)其缩写名则由物种英文名称的字首、品种名头两个字拼音字首、性别（公为11、母为12）、

采样组织的英文的字首、细胞系编号（用阿拉伯数字表示）、培养代数（F0-FN）组成。

c)如从撒坝公猪耳缘组织采样所建立的成纤维细胞系1第1代细胞，其中文名为“撒坝公猪耳缘

成纤维细胞系1第1代细胞”，缩写名为“PSb11E1F1”，命名表参见附录A中表A.3。

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附录A

（资料性附录）

采样记录表、细胞冻存记录表、细胞系命名表

A.1采样记录表

采样记录表见表A.1。

表A.1采样记录表

物种

采

样

记

录

品种

年龄

性别

采样地点

采样部位

记录人：

A

A.2细胞冻存记录表

细胞冻存记录表见表A.2。

表A.2细胞冻存记录表

冷冻日期

每个冻存管的冻存量（mL）

冻存管的总数（个）

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