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玉米粗缩病病原免疫斑点检测方法

玉米粗缩病是一种严重影响玉米产量和质量的病害，其病原主要是玉米粗缩病毒（Maizeroughdwarfvirus，MRDV）。免疫斑点检测方法是一种基于抗原-抗体反应的检测技术，具有灵敏度高、特异性强、操作简便等优点，可用于快速检测玉米粗缩病病原。

实验材料与试剂准备

1.实验材料：待检测的玉米叶片样本、阳性对照（已知感染玉米粗缩病毒的叶片样本）、阴性对照（健康玉米叶片样本）。

2.试剂

-包被缓冲液：称取1.59g碳酸钠、2.93g碳酸氢钠，加蒸馏水定容至1000mL，调pH至9.6。

-封闭液：5%脱脂奶粉（用洗涤缓冲液配制）。

-洗涤缓冲液：称取8.0g氯化钠、0.2g氯化钾、3.63g磷酸氢二钠、0.24g磷酸二氢钾，加蒸馏水定容至1000mL，再加入0.05%吐温-20，调pH至7.4。

-抗体：抗玉米粗缩病毒的单克隆抗体和酶标二抗（辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG）。

-底物溶液：称取0.08g邻苯二胺，加入100mL柠檬酸-磷酸缓冲液（pH5.0），临用前加入30μL30%过氧化氢。

-终止液：2mol/L硫酸。

样本处理

1.称取0.1g玉米叶片样本，放入研钵中，加入1mL提取缓冲液（一般使用洗涤缓冲液），充分研磨成匀浆。

2.将匀浆液转移至1.5mL离心管中，10000r/min离心10min，取上清液作为待检样本。

检测步骤

1.点样

-用移液器分别吸取5μL待检样本、阳性对照和阴性对照，点加到硝酸纤维素膜（NC膜）上，室温干燥2h或37℃烘干30min，使抗原固定在膜上。

-在膜上做好标记，防止混淆不同样本。

2.封闭

-将点样后的NC膜放入封闭液中，室温摇床孵育1h，以封闭膜上未结合抗原的位点，减少非特异性结合。

3.加一抗

-弃去封闭液，用洗涤缓冲液洗涤NC膜3次，每次5min。

-将抗玉米粗缩病毒的单克隆抗体用稀释液（一般用3%脱脂奶粉的洗涤缓冲液）按一定比例（如1:1000）稀释后，将NC膜浸入其中，4℃过夜或室温摇床孵育2h，使抗原与抗体充分结合。

4.洗涤

-弃去一抗溶液，用洗涤缓冲液洗涤NC膜4次，每次5min，以去除未结合的一抗。

5.加二抗

-将酶标二抗用稀释液按合适比例（如1:5000）稀释，将NC膜浸入二抗溶液中，室温摇床孵育1h，使二抗与一抗结合。

6.洗涤

-弃去二抗溶液，用洗涤缓冲液洗涤NC膜5次，每次5min，充分去除未结合的二抗。

7.显色

-将NC膜放入底物溶液中，室温避光显色10-20min，直到出现明显的颜色变化。在显色过程中，观察膜上斑点颜色变化，阳性样本斑点会逐渐显现棕色或深褐色。

8.终止反应

-当达到合适的显色程度后，将NC膜取出，放入终止液中终止反应。

9.结果判断

-阳性对照应出现明显的棕色或深褐色斑点，阴性对照无颜色变化。待检样本中，如果出现与阳性对照类似的棕色或深褐色斑点，则判断为阳性，表明样本中含有玉米粗缩病毒；如果无颜色变化，则判断为阴性，表明样本中未检测到玉米粗缩病毒。

注意事项

1.实验操作过程中要严格遵守无菌操作原则，避免污染。

2.试剂的配制要准确，特别是抗体和底物溶液，其浓度会影响检测结果的灵敏度和准确性。

3.点样时要保证样本点的大小和形状一致，避免样本间交叉污染。

4.洗涤步骤要充分，以减少非特异性结合，降低假阳性结果的出现。

5.显色时间要控制合适，过长或过短都会影响结果的判断。

6.所有使用过的试剂和材料要进行妥善处理，防止污染环境。

试题部分

1.玉米粗缩病的病原主要是什么？

A.细菌

B.真菌

C.病毒

D.线虫

答案：C

分析：玉米粗缩病的病原主要是玉米粗缩病毒（MRDV）。

2.免疫斑点检测方法的原理是基于什么反应？

A.抗原-抗体反应

B.氧化还原反应

C.水解反应

D.聚合反应

答案：A

分析：免疫斑点检测是基于抗原-抗体特异性结合的原理。

3.包被缓冲液的pH值一般为多少？

A.7.4

B.9.6

C.5.0

D.8.0

答案：B

分析：包被缓冲液调pH至9.6。

4.封闭液中脱脂奶粉的浓度一般为多少？

A.1%

B.3%

C.5%

D.10%

答案：C

分析：封闭液一般用5%脱脂奶粉（用洗涤缓冲液配制）。

5.洗涤缓冲液中加入吐温-20的作用是什么？

A.调节pH值

B.增加溶液的粘度

C.减少非特异性吸附

D.提供营养物质

答案：C

分析：吐温-20可减少非特异性吸附，使洗涤效