DB13T 5345-2021 猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪圆环病毒2型二重PCR检测方法.docxVIP

ICS65.020.30CCSB41

DB13

河北省地方标准

DB13/T5345—2021

猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪圆环病毒2

型二重PCR检测方法

2021-01-21发布2021-02-21实施

河北省市场监督管理局发布

DB13/T5345—2021

I

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第一部分：标准化文件的结构与起草规则》的规定起草。

本文件由河北农业大学提出。

本文件起草单位：河北农业大学。

本文件主要起草人：袁万哲、赵款、张建虹、王建昌、韩荞忆、李丽敏、宋勤叶、董世山、李希明、张磊、李睿文、白云、郝雪飘。

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猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪圆环病毒2型二重PCR检测方法

1范围

本文件规定了猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪圆环病毒2型二重PCR检测方法的技术要求。

本文件适用于猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪圆环病毒2型的同时检测。

2规范性应用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范

3本文件没有需要界定的术语和定义。

4试剂材料

4.1病毒核酸提取试剂盒。

4.21.0%琼脂糖凝胶，配制方法见附录A中A.1。

4.350×TAE缓冲液，配制方法见附录A中A.2。

4.4溴化乙锭（EB，10ug/μL）或市售核酸染料，配制方法见附录A中A.3。

4.5焦碳酸二乙酯（DEPC）处理的灭菌双蒸水，配制方法见附录A中A.4。

4.6DNA分子量标准（100bp）。

4.7反转录酶。M-MLV反转录酶（200U/μL）或AMV反转录酶（10U/μL）

4.8RNA酶抑制剂。

4.92×TaqMasterMix。含有PCR缓冲液、酶混合物、dNTP混合物、无RNA酶的水等。

4.10dNTP。浓度为2.5mM。

4.11引物。反转录引物、上游引物与下游引物见附录B中的表B.1。引物浓度为10μmol/L。

5仪器设备

5.1PCR仪。

5.2凝胶成像系统。

5.3台式低温高速离心机。

5.4电泳仪。

5.5电泳槽。

5.6冰箱。

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5.7微量移液器。单道可调；量程包括0.5μL～10μL、2μL～20μL、10μL～100μL、100μL~1000μL。

5.8水浴锅。

6样品

6.1阴阳性对照

以灭活的猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪圆环病毒2型细胞培养物或者感染猪组织作为阳性对照，以正常细胞或者是正常猪组织作为阴性对照。对照均应在-20℃保存。

6.2样品的采集与处理

6.2.1采集工具

下列采集工具应进行灭菌处理：

a)棉拭子；

b)剪刀；

c)镊子；

d)1.5mL离心管；

e)研钵；

f)一次性无菌采样袋。

6.2.2棉拭子采集

将棉拭子深入鼻腔转一圈；将采集后的棉拭子放入盛有1.0mLPBS（配制方法见附录A中A.5）的1.5mL离心管，编号。

6.2.3血液采集

使用一次性注射器或采血管通过耳静脉或前腔静脉采血3mL～5mL，编号。

6.2.4组织采集

剖检生猪，用剪刀采集肺、脾、肾、淋巴结等组织，装入一次性无菌采样袋，编号。

6.2.5样品储运

样品采集后放入塑料袋内密封（一个采集点的样品放一个塑料袋内），样品的储存应按照NY/T541中条款7.1执行；样品的运输应按照NY/T541中条款9执行。

6.2.6样品的处理

6.2.6.1棉拭子

将装有棉拭子的离心管在混合器上充分混合后，用高压灭菌的镊子将拭子中的液体挤出，4℃条件下3000r/min离心15min，取上清液转入无菌的1.5mL离心管中，编号备用。

6.2.6.2血液

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待血液凝固后，4℃条件下5000r/min离心10min取上清液转入无菌的1.5mL离心管中，编号备用。

6.2.6.3组织

将所采集的组织置于洁净、灭菌并烘干的搪瓷盘中，称取组织按照质量体积比（1:5）加入样品保存液进行充分研磨，4℃条件下3000r