第四章基因克隆的载体.pptVIP

1.4.1.质粒载体的选择记号新陈代谢特性；对大肠杆菌素E1的免疫性；抗菌素抗性；四环素抗性、氨苄青霉素抗性、链霉素抗性、卡那霉素抗性大多数质粒本身带有抗菌素基因；抗菌素抗性记号便于操作、易于选择。第30页，共83页，星期日，2025年，2月5日1.5不同类型的质粒载体高拷贝的质粒载体克隆的目的是为分离大量的高纯度的克隆基因低拷贝的质粒载体有些克隆的编码基因，其产物含量过高会严重的干扰寄主细胞的正常新陈代谢活动。编码表面结构蛋白质的一些基因、调节细胞基础代谢活动的蛋白质编码基因以及囊纤维化跨膜传导调节蛋白质编码基因等。第31页，共83页，星期日，2025年，2月5日(1)失控的质粒载体复制控制是温度敏感型的低拷贝的质粒。Example：pBEU1和pBEU2质粒，在30度下，每个寄主细胞只含有适量的拷贝数，当培养温度超过35度时，质粒的复制将失去控制，每个细胞中的拷贝数便持续上升。在这种高温环境下，细胞的生长和蛋白质的合成可按正常的速率持续2～3小时。最后得到超量的基因编码产物，细胞生长受抑制失去存活能力，积累的质粒DNA占细胞总DNA的50%。第32页，共83页，星期日，2025年，2月5日(2)插入失活型质粒载体将外源DNA片断插入在质粒上会导致选择记号基因失活的位点，就有可能通过抗菌素抗性的筛选，大幅度的提高获得阳性克隆的机会。Example：在pBR329质粒载体的EcoR1位点插入外源片断，会使氯霉素抗性基因失活，在筛选的氯霉素敏感的转化子细胞群体中，含有插入片断的重组体质粒的几率会显著上升。第33页，共83页，星期日，2025年，2月5日(3)正选择的质粒载体正向选择：应用只有突变体或重组体才能正常生长的培养条件进行选择。这种质粒载体具有直接选择记号并可赋予寄主细胞相应的表型。第34页，共83页，星期日，2025年，2月5日Example：质粒pKN80有来自Mu噬菌体DNA的EcoR1-C的片断，编码一种致死功能的kil基因。该质粒在Mu噬菌体的溶源菌株中正常复制；在非溶源菌株中是致死的。在Hind?或Hpa?位点插入外源DNA片断后，会产生具Ampr表型的Mu噬菌体的非溶源的转化子菌株第35页，共83页，星期日，2025年，2月5日正向选择质粒载体的条件限制：1、需要特殊的寄主菌株或选择培养基2、可使用的克隆位点少3、假阳性水平高4、不能够调节插入序列表达活性第36页，共83页，星期日，2025年，2月5日(4)表达型的质粒载体表达载体：按特殊设计构建的，能使克隆在其中特定位点的外源真核基因的编码序列，在大肠杆菌细胞中正常转录并转译成相应蛋白质的克隆载体。第37页，共83页，星期日，2025年，2月5日主要包括：大肠杆菌的启动子、及操纵位点序列、多克隆位点、转录及转译信号、质粒载体的复制起点及抗菌素抗性基因。待表达的真核基因编码序列被克隆在紧挨于启动子下游的多克隆位点上，而且必须是其编码的蛋白质氨基酸末端这一头靠近启动子方向插入，才能在启动子控制下进行有效的转录。第38页，共83页，星期日，2025年，2月5日第39页，共83页，星期日，2025年，2月5日1.6重要的大肠杆菌质粒载体1、pSC101质粒载体；2、ColE?质粒载体；3、pBR322质粒载体；4、pUC质粒载体；5、其它的重要的质粒载体第40页，共83页，星期日，2025年，2月5日1.6.1pSC101质粒载体一种严谨型复制控制的地拷贝数的大肠杆菌质粒载体。平均每个寄主细胞仅有1～2个拷贝；分子量9.09kb，编码有一个四环素抗性基因（tetr）。有Hind?、EcoR?、BamH?、Sal?、Xho?、Pvu?、Sma?7种核酸内切限制酶。其中在Hind?、BamH?、Sma?3个位点克隆外源DNA，都会导致tetr基因失活。是第一个真核生物的克隆载体第41页，共83页，星期日，2025年，2月5日第42页，共83页，星期日，2025年，2月5日Example1:应用pSC101质粒作基因克隆载体—