宿主细胞或菌体蛋白残留量的检查法第二节第十章生物制品的生物.pptxVIP

宿主细胞（或菌体）蛋白残留量的检查法第二节第十章生物制品的生物测定法

一.概念第二节宿主细胞（或菌体）蛋白残留量的检查法宿主细胞（或菌体）的残留蛋白是指与生物制品生产用的细胞、工程菌相关的特殊蛋白杂质。对该类生物制品的检定应按照《中国药典》现行版三部的规定来严格测定和控制异源蛋白的含量，以防其超量而导致机体出现的各种不良免疫反应，确保该类产品的质量和安全性。

二.原理及方法1.方法根据《中国药典》（2020年版）的规定，目前对宿主细胞（或菌体）蛋白残留量的测定主要采用的是酶联免疫吸附试验检测方法（enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA）第二节宿主细胞（或菌体）蛋白残留量的检查法

二.原理及方法第二节宿主细胞（或菌体）蛋白残留量的检查法2.原理根据抗原-抗体反应的特点，先将抗体（抗原）包被在固相载体表面后，按不同的步骤加入待测抗原（抗体）和酶标记的抗体（抗原），待其充分反应后，用洗涤的方法将固相载体上形成的特异性抗原-抗体复合物与其他物质分离，洗去未结合的游离酶标抗体（抗原），最后加入酶的底物，根据酶对底物催化的显色反应的程度，对标本中的抗原（抗体）进行定性或定量检测。

3.ELISA（双抗体夹心法）方法举例大肠埃希菌表达系统生产的重组生物制品中残留菌体蛋白含量测定方法的基本步骤为:（1）包被抗体：将特异性抗体与固相载体连接，形成固相载体，洗涤除去未吸附的抗体和杂质。（2）加待测标本并孵育：使标本中的待测抗原与上述固相抗体充分反应，形成固相抗原-抗体复合物，洗涤除去其他未结合的游离抗原和杂质.第二节宿主细胞（或菌体）蛋白残留量的检查法二.原理及方法

（3）加酶标抗体孵育：使固相抗原抗体复合物中的抗原再与相应的酶标抗体相结合，形成固相抗体-待测抗原-酶标抗体复合物（即双抗体夹心法），洗涤除去未结合的酶标抗体和其他杂质。（4）加底物显色：固相上的辣根过氧化物酶催化加入的底物（邻苯二胺）形成橙色产物，根据颜色反应的程度来进行该抗原的定性或定量检测。最后加入终止液（硫酸）终止反应。第二节宿主细胞（或菌体）蛋白残留量的检查法/#/bookPreview?bookId=20369id=491567resourceType=videoeisbn=978-7-117-25691-9_V1.1

用酶标仪在492nm波长处测定吸光度，以不同浓度的标准品溶液的吸光度做出工作曲线，由此可以测出重组生物制品中所残留的大肠埃希菌菌体蛋白的含量。第二节宿主细胞（或菌体）蛋白残留量的检查法SM-3酶标仪

第二节宿主细胞（或菌体）蛋白残留量的检查法三.实例本法采用酶联免疫法测定大肠埃希菌表达系统生产的重组制品中菌体蛋白质残留量。（《中国药典》（2020年版）三部通则3412）1.方法原理重组人粒细胞刺激因子注射液原液的宿主菌蛋白质残留量测定

（1）溶液的配制第二节宿主细胞（或菌体）蛋白残留量的检查法2.实验步骤2.实验步骤132465包被液（pH9.6碳酸盐缓冲液）磷酸盐缓冲液（pH7.4）洗涤液（pH7.4）浓稀释液底物缓冲液78底物液终止液稀释液（PH7.4）

（2）标准品溶液的制备按菌体蛋白质标准品说明书加水复溶，精密量取适量，用稀释液稀释成每1ml中含菌体蛋白质500ng、250ng、125ng、62.5ng、31.25ng、15.625ng、7.8125ng的溶液。第二节宿主细胞（或菌体）蛋白残留量的检查法（3）供试品溶液的制备取供试品适量，用稀释液稀释成每1ml中约含250μg的溶液。如供试品每1ml中含量小于500μg时，用浓稀释液稀释1倍。

（4）测定法a.取兔抗大肠埃希菌菌体蛋白质抗体适量，用包被液溶解并稀释成每1ml中含10μg的溶液，以100μl/孔加至96孔酶标板内，4℃放置过夜（16～18小时）。b.用洗涤液洗板3次；用洗涤液制备l%牛血清白蛋白溶液，以200μl/孔加至酶标板内，37℃放置2小时。c.将封闭好的酶标板用洗涤液洗板3次；以100μl/孔加入标准品溶液和供试品溶液，每个稀释度做双孔，同时加入2孔空白对照(稀释液)，37℃放置2小时。第二节宿主细胞（或菌体）蛋白残留量的检查法

d.用稀释液稀释辣根过氧化物酶（HRP）标记的兔抗大肠埃希菌菌体蛋白质抗体1000倍，以100μl/孔加至酶标板内，37℃放置1小时，用洗涤液洗板10次，以100μl/孔加入至酶标板内，37℃避光放置40分钟，以50