第二节基因工程的基本操作程序公开课.pptVIP

第1页，共37页，星期日，2025年，2月5日苏云金芽孢杆菌（有抗虫特性）提取抗虫基因与运载体DNA拼接普通棉花植株导入基因工程培育抗虫棉目的基因的获得将目的基因导入受体细胞基因表达载体的构建重组质粒（重组DNA分子）抗虫性鉴定抗虫棉花植株目的基因的检测与鉴定第2页，共37页，星期日，2025年，2月5日第二节基因工程的基本操作程序第3页，共37页，星期日，2025年，2月5日1.目的基因（外源基因）：所感兴趣的基因一、目的基因的获取目前被广泛提取使用的目的基因有：苏云金杆菌抗虫基因、植物抗病基因（抗病毒、抗细菌)、人胰岛素基因等。第4页，共37页，星期日，2025年，2月5日2、获得目的基因的方法人工合成利用PCR技术扩增已知序列未知序列从基因文库获得供体生物细胞取出DNA用限制酶剪去多余部分目的基因第5页，共37页，星期日，2025年，2月5日（1）人工合成蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列目的基因推测推测化学合成①化学合成法：目的基因的mRNA单链DNA(cDNA）双链DNA(即目的基因)逆转录（逆转录酶）合成（DNA聚合酶）②逆转录法：当基因比较小、核苷酸序列已知或蛋白质的氨基酸序列可以测得时序列已知第6页，共37页，星期日，2025年，2月5日PCR(polymerasechainreaction)——聚合酶链式反应（2）利用PCR技术扩增目的基因根据DNA双链复制的基本原理，模拟体内复制过程，在生物体外复制特定DNA片段的技术第7页，共37页，星期日，2025年，2月5日体内PCR（体外）双链DNA双链DNA单链DNA解旋（解旋酶）单链DNA高温变性（加热至90～95℃）合成RNA引物（RNA聚合酶）低温退火（复性）（冷却至55～60℃）引物与单链互补结合适温延伸（加热至70～75℃）双链子DNA热稳定ＤＮＡ聚合酶分别以DNA的两条链为模板合成子链DNA聚合酶双链子DNA过程第8页，共37页，星期日，2025年，2月5日第9页，共37页，星期日，2025年，2月5日一次性吸液枪头调节轮卸枪头按钮推动按钮卸枪头器微量移液器第10页，共37页，星期日，2025年，2月5日利用PCR技术扩增目的基因第11页，共37页，星期日，2025年，2月5日四种脱氧核苷酸(dNTP)一对引物：热稳定DNA聚合酶(Taq酶）模板DNA(需含有目的基因)Mg2+(激活剂)条件：缓冲溶液与目的基因的起始段互补有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物前提：2n循环n次后，共有DNA分子：第12页，共37页，星期日，2025年，2月5日（3）从基因文库中获取目的基因基因组文库cDNA文库过程提取基因组DNA限制性核酸内切酶酶切与运载体连接导入受体细胞mRNAcDNA(单链）双链DNA逆转录与运载体连接导入受体细胞将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。（序列未知）第13页，共37页，星期日，2025年，2月5日基因组文库部分基因文库文库类型基因组文库cDNA文库基因多少某种生物的全部基因某种生物的部分基因文库大小大小是否有非编码区有无是否有内含子有无第14页，共37页，星期日，2025年，2月5日①用一定的限制性核酸内切酶切割质粒，使其出现一个有黏性末端的切口；②用同种限制酶切断目的基因，产生相同的黏性末端；③将切下的目的基因片段，插入到质粒的切口处，再加入适量DNA连接酶，使两者结合成重组质粒(重组DNA)。1.以质粒为载体，构建重组DNA的步骤：二、基因表达载体的构建——核心第15页，共37页，星期日，2025年，2月5日质粒目的基因限制酶DNA连接酶重组DNA第16页，共37页，星期日，2025年，2月5日质粒DNA分子限制酶处理一个切口两个黏性末端两个切口获得目的基因DNA连接酶重组DNA分子（重组质粒）同一种第17页，共37页，星期日，2025年，2月5日2.基因表达载体的组成：目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。a、目的基因b、启动子c、终止子d、标记基因e、复制原点第18页，共37页，星期日，2025年，2月5日1.导入微生物细