荧光定量实验技术.pptVIP

质粒标准品稀释方法*倍比梯度稀释方法：1v原液(标准品i)+9v稀释缓冲液，得标准品ii1v标准品ii+9v稀释缓冲液，得标准品iii1v标准品iii+9v稀释缓冲液，得标准品iv1v标准品iv+9v稀释缓冲液，得标准品v*第30页，共51页，星期日，2025年，2月5日绝对定量实验例－－毕赤酵母A基因的绝对定量*方法：检测毕赤酵母的A基因标准品：质粒标准品浓度为5个浓度；3个重复；设阴性空白对照实验步骤：提取ADNA；设计特异引物；设计TaqMan探针并标记探针；荧光定量扩增；结果分析：获取毕赤酵母的A的精确copy数。*第31页，共51页，星期日，2025年，2月5日绝对定量实验例－－毕赤酵母A基因的绝对定量*Samplecopies/mlCt1Ct3Ct2MeanCtSTD标准品1.41×10522.3322.2022.4622.330.13标准品1.41×10618.7018.3218.6118.540.20标准品1.41×10715.0915.1515.3715.200.19标准品1.41×10811.7811.9811.6211.790.18标准品1.41×1098.308.358.268.300.046未知样品?18.4418.4718.4418.450.024空白对照NoneNone*第32页，共51页，星期日，2025年，2月5日绝对定量实验例－－毕赤酵母A基因的绝对定量*扩增效率（E）计算E=10-1/斜率-1=10-1/-3.481-1=1.983-1=0.938标准曲线制作：利用MeanCt作图可得到标准曲线y=-3.481x+40.123R2=0.9996相关系数（R2）：大于0.98，越接近1，结果可信度越高。扩增效率（E）：0.8-1.2,越接近1，越理想。*第33页，共51页，星期日，2025年，2月5日绝对定量实验例－－毕赤酵母A基因的绝对定量*未知样品拷贝数的计算将Ct值带入线性方程：18.45=-3.481X+40.123QuantityUnknown=106.226=1682674copiesX=18.45-40.123-3.481=6.226*第34页，共51页，星期日，2025年，2月5日相对定量的必要性*SampleBSampleA目的基因扩增效率相同RNA提取效率相同细胞起始数相同实际目的基因表达量分析*第35页，共51页，星期日，2025年，2月5日相对定量分析方法*比较两个或两个以上样本中某个基因表达量的变化！关注点：基因的相对表达量，而不是基因的绝对量！*第36页，共51页，星期日，2025年，2月5日荧光定量实验技术第1页，共51页，星期日，2025年，2月5日内容概要荧光定量PCR的原理荧光定量PCR解析方法荧光定量实验流程荧光定量PCR仪生工荧光定量产品选择指南*第2页，共51页，星期日，2025年，2月5日荧光定量PCR原理－－定义实时定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，对起始模板进行定量分析与常规PCR技术比较：对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析，无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测*第3页，共51页，星期日，2025年，2月5日荧光定量PCR原理－－标记方法*SYBRGreenI*TaqManProbe分子信标第4页，共51页，星期日，2025年，2月5日SYBRGreenI染料法－－SYBRGreenI*SYBRGreenI是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。SYBRGreenI*第5页，共51页，星期日，2025年，2月5日SYBRGreenI染料法－－作用机理**第6页，共51页，星期日，2025年，2月5日SYBRGre