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重组真核表达质粒pVAX1-SPG的构建、表达及特性探究

一、引言

1.1研究背景与意义

在现代生命科学领域，重组真核表达质粒的构建及表达研究具有举足轻重的地位，是深入探索基因功能、研发新型生物制品以及开展基因治疗等前沿研究的核心技术支撑。随着生物技术的迅猛发展，人们对基因奥秘的探索不断深入，期望通过精准操控基因的表达，来揭示生命活动的本质规律，攻克一系列困扰人类健康的重大疾病难题。

真核表达系统因其能够对蛋白质进行正确的折叠、修饰和加工，从而生产出具有天然活性和功能的蛋白质，在基因工程领域中备受青睐。其中，质粒作为一种常用的基因载体，能够携带外源基因进入宿主细胞，并实现基因的稳定表达。pVAX1质粒是在载体pcDNA3.1的基础上改建而成的新型真核表达载体，由美国食品和药品管理委员会（FDA）推荐，可应用于人体实验，为解决DNA疫苗应用于人体实验的难题带来希望。其大小约为3.0kb，用卡那霉素抗性筛选基因替代了pcDNA3.1中的氨苄霉素抗性筛选基因，最大程度减少了抗性筛选基因与人类基因组发生重组的可能性，保障了实验的安全性和可靠性。同时，pVAX1含有多个克隆酶切位点，允许同时克隆多个大片段的目的基因，为基因的组合和改造提供了便利条件；其强启动子pCMV和BGHpolyA信号能够在哺乳动物细胞中驱动重组蛋白的高水平表达，有助于获得大量具有生物活性的目标蛋白，满足后续研究和应用的需求。此外，作为一种非融合载体，pVAX1要求插入序列中必须包含一段KozaK的翻译起始序列和一个起始密码子（ATG）以引导正确的翻译，典型的KozaK共有序列为“ANNATGG”，其-3位的A和+4位的G对正确插入至关重要，在插入序列中还需包括一个终止密码子以正确终止基因表达，这些严格的序列要求确保了蛋白质翻译过程的准确性和高效性。

pVAX1-SPG质粒作为一种特定的重组真核表达质粒，在多个领域展现出巨大的潜在应用价值。在医学领域，尤其在疾病的预防和治疗方面，具有广阔的应用前景。以肿瘤防治为例，肿瘤的发病率逐年上升，传统治疗方式存在诸多弊端，如外科手术创伤大、放化疗副作用明显等，难以达到理想的治疗效果。利用pVAX1为载体构建肿瘤DNA疫苗成为肿瘤防治的新方向。有研究通过构建含特定基因片段的pVAX1重组质粒，如从重组质粒pGEM-T-EN扩增出编码内皮他定的基因片段，经酶切后定向插入pVAX1构建pVAX-sEN，将其注射到肝癌动物模型体内，发现癌组织明显变小，肿瘤组织内毛细血管密度降低，为肿瘤治疗提供了新的思路和方法。在口腔疾病防治方面，pVAX1-SPG质粒同样发挥着重要作用。龋齿是口腔常见多发病，严重危害人类健康，变形链球菌是其主要致病菌。pVAX1-SPG质粒可能携带与变形链球菌相关的抗原基因，通过免疫机体，激发免疫系统产生针对变形链球菌的特异性免疫反应，从而达到预防和治疗龋齿的目的，为口腔疾病的防治开辟了新的途径。

在生物技术研究中，pVAX1-SPG质粒为蛋白质表达和功能研究提供了有力工具。通过将目标基因克隆到pVAX1-SPG质粒上，转染到合适的宿主细胞中，能够实现目标蛋白的高效表达，有助于深入研究蛋白质的结构与功能关系，揭示生命活动的分子机制。在工业生产领域，利用pVAX1-SPG质粒构建的工程菌株或细胞系，可用于生产具有重要价值的生物制品，如药用蛋白、酶制剂等，提高生产效率和产品质量，降低生产成本，具有显著的经济效益和社会效益。

本研究致力于重组真核表达质粒pVAX1-SPG的构建及表达研究，旨在成功构建pVAX1-SPG质粒，并深入探究其在真核细胞中的表达特性，包括表达时间、表达水平以及表达产物的生物学活性等。通过全面系统的研究，不仅能够丰富和完善真核表达质粒的理论体系，为基因工程技术的发展提供坚实的理论基础，还能为pVAX1-SPG质粒在医学、生物技术和工业生产等领域的实际应用提供关键的技术支持和实践经验，推动相关领域的技术创新和产业发展，具有重要的理论意义和实际应用价值。

1.2研究目的与主要内容

本研究旨在成功构建重组真核表达质粒pVAX1-SPG，并深入探究其在真核细胞中的表达特性，包括表达时间、表达水平以及表达产物的生物学活性等，为其在医学、生物技术和工业生产等领域的实际应用提供关键的技术支持和实践经验。具体研究内容如下：

构建真核表达质粒pVAX1-SPG：利用PCR技术从目标表达物的基因组中扩增出编码区域的DNA序列，该序列包含与目标蛋白相关的关键基因片段，其准确性和完整性直接影响后续质粒构建的成败。将扩增得到的DNA