细胞工程第十章动物细胞大规模培养技术.pptVIP

悬浮培养过程依据使用培养模式的不同分为批式再灌注培养、流加补料培养和灌流培养三种。自1996－2000年美国FDA批准的70％的重组治疗药物，如重组蛋白或抗体等，均是搅拌罐反应器悬浮培养生产的。悬浮培养的驯化悬浮培养的细胞对培养环境的要求较高，培养液组成部分和培养条件对高细胞密度培养具有重要作用。无血清悬浮培养是用已知的蛋白或激素替代动物血清的一种细胞培养方式，它能减少后期纯化工作，提高产品质量。细胞对无血清培养条件的适应能力和生长形式的驯化，对于建立优化的无血清高密度培养工艺非常重要。第30页，共71页，星期日，2025年，2月5日用重组技术或细胞融合技术建立的工程细胞系，在进行无血清悬浮培养或高密度培养时，都需经过一定时间的细胞适应能力驯化。高细胞密度无血清悬浮培养的转化，可以导致细胞生长形成的转变和分泌蛋白特异性结构上的转变。随着血清浓度的减少或细胞生长添加剂的去除，细胞生长速率逐渐下降。另外，工程细胞分泌蛋白的糖结构形式，也常同时出现明显的改变，造成表达蛋白质的特异性改变。第31页，共71页，星期日，2025年，2月5日通过驯化期可以逐渐修复那些不适宜的细胞群体，在驯化过程中监控并筛选那些具有优化性能特性（如细胞生长率、产生率、细胞死亡率、基因稳定性等）的细胞克隆或细胞群。悬浮培养的驯化主要包括无血清培养条件的驯化、高细胞密度培养的驯化和贴壁生长转化为悬浮生长的驯化三个方面。对贴壁生长细胞转化为悬浮生长细胞，其驯化的时间和难易程度各异。以CHO细胞为例，由单层培养到悬浮培养驯化方法和过程主要分以下7步。第32页，共71页，星期日，2025年，2月5日（1）用含有血清的标准培养液单层培养贴壁生长细胞，弃去培养液，用胰蛋白酶消化单层培养贴壁细胞，然后用灭菌的无钙、镁离子的PBS洗两次。（2）弃去PBS，加3mL（T－75培养瓶加5mL）的胰蛋白酶-EDTA消化液（0.5g／L胰蛋白酶，0.53mmol／LEDTA-2Na），在显微镜下观察，细胞开始变圆，轻拍培养瓶，使细胞脱落。（3）加6-10mL悬浮细胞培养液，100g离心4min，吸弃上清，用无血清培养液重悬细胞，活细胞计数。（4）用灭菌的搅拌瓶，加适当的培养液悬浮培养细胞，起始密度保持5×105活细胞／mL，搅拌瓶或培养瓶需有良好的气体供应系统。无血清培养液对搅拌剪切力的保护较差，需加入PluronicF68，终浓度0.l％。第33页，共71页，星期日，2025年，2月5日（5）培养条件37℃，5％CO2，搅拌速度在75-95r／min，如果细胞活性低于85％，降低转速为10r／min，即时检测活细胞密度，建立悬浮培养的细胞生长曲线。（6）如果发现培养瓶中存在明显的贴壁细胞或聚集成团，可以加入少量的胰蛋白酶（0.1g／L）和Versene（0.01％）混合物，37℃下搅拌30min，离心收集细胞；如果仍存在细胞聚集、贴壁现象，可在细胞生长液中加入少量（20-50μg／mL）胰蛋白酶或分散酶。（7）一旦细胞密度达到l×106mL，活性大于90％，持续传代培养三代以上，可进一步放大悬浮培养，种子细胞密度至少2×105－3×105个／mL。第34页，共71页，星期日，2025年，2月5日（8）无血清培养的驯化是一个使细胞从有血清培养条件，逐渐适应过渡到无血清培养的过程。当细胞在某一血清浓度下生长良好时，可以继续降低血清浓度。一般在5％-10％的血清浓度范围培养条件下，细胞的适应性、细胞生长率、细胞产量、细胞密度和基因表达稳定性等都不会有显著的变化。从5％降到1％时，细胞适应需要一个过程，每次降低血清浓度的速度应减慢，一般为每次降低50％－100％；血清浓度等于或低1％时，需要添加血清替代物和细胞生长因子，并随时检测细胞的各种生物学特性指标。假如某一血清浓度的培养出现细胞生长危机时，细胞生长率明显减慢、产物表达不稳定、细胞或产物表达量明显降低等，则应放慢适应过程或放弃这一浓度，转到前一步使血清浓度的降幅减小，并调整无血清培养液中添加剂的成分（如胰岛素、转铁蛋白、清蛋白、乙醇胺和2-ME等）的含量，进一步对无血清培养液进行优化；连续几个月的无血清培养后，细胞的生长率、细胞产量、细胞密度和产物表达稳定性和特异性结构方面都与有血清培养条件下无明显差异，则可以得到无血清培养细胞系。第35页，共71页，星期日，2025年，2月5日无血清悬浮培养驯化应考虑的问题有以下8个方面。①细胞在驯化过程中对外界环境如pH、温度和渗透压等都较敏感。②每次培养前需要进行一段时间的连续性适应。③每次转换培养条件，细胞须处在对数生长期，活性应大于90％。④避免培养液过多过长时间的暴