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乙型肝炎病毒B、C基因型X蛋白于原核系统的克隆、表达与纯化探究

一、引言

1.1研究背景与意义

1.1.1乙型肝炎的危害与现状

乙型肝炎是一种严重威胁人类健康的全球性公共卫生问题。据世界卫生组织（WHO）统计，全球约有20亿人曾感染过乙型肝炎病毒（HBV），其中慢性乙型肝炎患者近2.4亿人，每年约有80万人死于HBV感染相关的肝衰竭、肝硬化和原发性肝细胞癌等疾病。HBV感染呈全球性分布，但不同地区的流行程度差异较大，可分为高、中、低流行区。高流行区（HBsAg流行率≥8%）主要包括撒哈拉以南非洲、东南亚和西太平洋地区，这些地区的感染人数占全球的大部分。在这些区域，由于卫生条件有限、医疗资源不足以及母婴传播等因素，导致HBV感染率居高不下。例如，在撒哈拉以南非洲的一些国家，HBV的携带率甚至高达15%-20%。中流行区（HBsAg流行率2%-7%）涵盖东欧、中东和部分拉丁美洲国家，这些地区的感染情况也不容忽视。低流行区（HBsAg流行率＜2%）主要是北美、西欧和澳大利亚等地区，但随着全球人口流动的增加，这些地区的HBV感染人数也呈上升趋势。在中国，虽然通过广泛实施乙肝疫苗接种，HBV感染率有所下降，但仍有7000万左右的慢性乙肝病毒感染者，是乙肝大国之一。

1.1.2HBV的结构与生活周期

HBV是一种嗜肝DNA病毒，其病毒颗粒呈球形或椭球形，直径约42纳米，也被称为Dane颗粒。它由外层包膜和内部核衣壳组成。外层包膜含有乙肝表面抗原（HBsAg）、前S1抗原和前S2抗原，这些抗原在病毒感染宿主细胞的过程中发挥重要作用，其中前S1蛋白与肝细胞受体之间的识别和介导，决定了HBV的嗜肝性。内部核衣壳则包含乙肝核心抗原（HBcAg）和病毒基因组。

HBV的基因组为不完全的环状双链DNA，长度约3.2kb，负链含3200个碱基，正链的长度可变。基因组中包含4个开放读码框（ORF），均位于负链，分别为S区、C区、P区和X区。S区又分为前S1、前S2及S三个编码区，分别编码包膜上的前S1蛋白、前S2蛋白及HBsAg；C区分为前C基因和C基因，编码HBeAg和HBcAg；P区编码一个大分子碱性多肽，含有多种功能蛋白，参与病毒的逆转录和复制过程；X区编码X蛋白（HBx）。

HBV的生活周期较为复杂。病毒首先通过低亲和力受体（如硫酸乙酰肝素、蛋白多糖等）黏附到肝细胞表面，再通过大包膜蛋白的preS1区与病毒受体钠离子-牛磺胆酸供转运多肽（NTCP）结合，介导细胞对病毒的内吞作用。在内吞体中，病毒包膜和吞体膜融合，将衣壳释放入细胞质，衣壳被运送至核孔复合体，内部的病毒基因组rcDNA释放入细胞核。在细胞核内，rcDNA通过细胞的DNA复制机制转化成共价闭合环状DNA（cccDNA），cccDNA具有高度的稳定性，在细胞核内可以维持数月至数年，这是抗病毒治疗结束后病毒反弹的根本原因，因此清除cccDNA对根治乙型肝炎具有决定性意义。病毒利用cccDNA转录出3.5kb、2.4kb、2.1kb及约0.8kb的mRNA，其中3.5kb为前基因组RNA（pgRNA），可反转录出基因组DNA并作为编码病毒核心蛋白和聚合酶蛋白的模板。HBsAg合成后在粗面内质网中多聚化，并转运至高尔基体前腔以包装核心颗粒，装配好的HBV颗粒与亚病毒颗粒转运至高尔基体进行HBsAg的糖基化修饰，最后以出芽方式将完整的病毒粒子分泌出宿主细胞，完成生活周期。

1.1.3X蛋白的重要作用

X蛋白（HBx）是由HBV的X基因编码的一种多功能蛋白，在HBV感染过程中发挥着至关重要的作用。

在HBV感染方面，HBx能够促进病毒的感染和复制。研究发现，HBx可以通过招募DDB1相关的E3泛素连接酶来降解宿主Smc5/6，从而解除Smc5/6对HBV基因组的限制作用，促进新的HBV病毒颗粒的产生。同时，HBx还可以调节病毒基因的转录和蛋白翻译过程，增强病毒的感染力。

在细胞周期调控方面，HBx可以干扰细胞正常的周期调控机制。它能够激活细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK），促进细胞从G1期进入S期，使细胞周期进程加快，为病毒的复制提供更有利的细胞环境。这种对细胞周期的异常调控可能导致细胞增殖失控，增加细胞癌变的风险。

在细胞凋亡调控方面，HBx的作用较为复杂。一方面，在某些情况下，HBx可以诱导细胞凋亡，可能是通过激活细胞内的凋亡信号通路，如线粒体途径等；另一方面，在另一些条件下，HBx又能抑制细胞