03 高效液相色谱分析.pptVIP

第3章高效液相色谱分析§3-1高效液相色谱法的特点HPLC与GC差别1．分析对象的区别GC：适于能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品；但对高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及高聚物的样品，尤其对大多数生化样品不可检测。占有机物的20%HPLC：适于溶解后能制成溶液的样品（包括有机介质溶液），不受样品挥发性和热稳定性的限制，对分子量大、难气化、热稳定性差的生化样品及高分子和离子型样品均可检测。用途广泛，占有机物的80%2．流动相差别的区别GC：流动相为惰性，气体组分与流动相无亲合作用力，只与固定相有相互作用。HPLC：流动相为液体，流动相与组分间有亲合作用力，能提高柱的选择性、改善分离度，对分离起正向作用。且流动相种类较多，选择余地广，改变流动相极性和pH值也对分离起到调控作用，当选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相也可以增大分离选择性。3．操作条件差别GC：加温操作HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）1.影响分离的因素——流速2.固定相及分离柱3.流动相及流动相的极性流动相组成选择流动相时应注意的几个问题：§3.2高效液相色谱法的主要分离类型3.离子交换色谱§3.6高效液相色谱仪2.主要部件(2)梯度洗提装置(3)进样装置(4)高效分离柱(5)高效液相色谱检测器光电二极管阵列检测器作业：P109第4、5、6、7题。**HighPertormanceLiquidChromatography，HPLC特点：高压、高效、高速、高灵敏度高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。在高效液相色谱中,速率方程中的分子扩散项B/u较小，可以忽略不计，而只有两项，即：H=A+Cu故液相色谱H-u曲线与气相色谱的形状不同，如图所示：影响分离的主要因素有流动相的流量、性质和极性。§3.2影响色谱峰扩展及色谱分离的因素流速大于0.5cm/s时,H～u曲线是一段斜率不大的直线。降低流速，柱效提高不是很大。但在实际操作中，流量仍是一个调整分离度和出峰时间的重要可选择参数。HPLC的柱效和流速比GC小近一个数量级。气相色谱中的固定液原则上都可以用于液相色谱，其选用原则与气相色谱一样。选择合适的固定相，降低填料粒度可显著提高柱效，但在高效液相色谱中，分离柱的制备是一项技术要求非常高的工作，一般很少自行制备。选择短柱、细内径提高分析速度；研制高效柱填料是一活跃领域。（1）可显著改变组分分离状况的流动相选择在液相色谱中显得特别重要。液相色谱的流动相又称为：淋洗液，洗脱剂。（2）亲水性固定液常采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定相的极性，称为正相液液色谱法，极性柱也称正相柱。（3）若流动相的极性大于固定液的极性，则称为反相液液色谱，非极性柱也称为反相柱。组分在两种类型分离柱上的出峰顺序相反。流动相按组成不同可分为单组分和多组分；按极性可分为极性、弱极性、非极性；按使用方式有固定组成淋洗和梯度淋洗。常用溶剂:己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。（1）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。（2）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。（3）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中沉积。（4）流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。1.吸附色谱（液-固吸附色谱）以固体吸附剂为固定相，如硅胶、氧化铝等，较常使用的是5～10μm的硅胶吸附剂。流动相可以是各种不同极性的一元或多元溶剂。2.分配色谱（液-液分配色谱）早期通过在担体上涂渍一薄层固定液制备固定相,现多为化学键合固定相，即用化学反应的方法通过化学键将固定液结合在担体表面。化学键合固定相的特点表面没有液坑，比一般液体固定相传质快得多；无固定液流失，增加了色谱柱的稳定性和寿命；可以键合不同官能团，能灵活地改变选择性，应用于多种色谱类型及样品的分析。有利于梯度洗提，也有利于配用灵敏的检测器和馏分的收集。固定