第三节基因工程载体.pptVIP

生命科学学院一、质粒表达载体融合型表达载体PSDForeignDNA融合型表达载体融合基因(一)原核表达载体第95页，共128页，星期日，2025年，2月5日生命科学学院一、质粒表达载体Ptac：IPTG诱导GST融合蛋白—直接纯化产物切割方便：pGEX-1?T—凝血酶pGEX-2T---凝血酶pGEX-3T---X因子位相载体融合型表达载体(一)原核表达载体第96页，共128页，星期日，2025年，2月5日生命科学学院一、质粒表达载体(一)原核表达载体分泌型表达载体1、主要元件：启动子和SD序列信号肽序列：SD下游，编码信号肽，可引导蛋白跨膜2、优点：分泌表达，避免降解。第97页，共128页，星期日，2025年，2月5日生命科学学院一、质粒表达载体(二)酵母表达载体原核生物和真核生物存在翻译后修饰反应机制的差异，真核基因在原核表达系统中难以获得有活性的蛋白。酵母是真核表达的首选系统酵母表达载体是一种穿梭表达载体：既能在大肠杆菌中繁殖，又能在酵母中复制、表达和选择。第98页，共128页，星期日，2025年，2月5日生命科学学院一、质粒表达载体(二)酵母表达载体DNA复制起始区（含两类复制起始序列）选择标记（营养缺陷型或显性选择标记）有丝分裂稳定区表达盒(启动子、分泌信号序列、终止子等)第99页，共128页，星期日，2025年，2月5日生命科学学院一、质粒表达载体(二)酵母表达载体第100页，共128页，星期日，2025年，2月5日生命科学学院一、质粒表达载体(二)酵母表达载体第101页，共128页，星期日，2025年，2月5日三、噬菌体-质粒杂合载体(一)柯斯质粒载体这是一类用于克隆大片段DNA的载体，它是由λ噬菌体的cos（cohesive）末端及质粒（plasmid）重组而成的载体。cosmid载体带有质粒的复制起点、克隆位点、选择性标记以及λ噬菌体用于包装的cos末端等，因此该载体在体外重组后，可利用噬菌体体外包装的特性进行体外包装，利用噬菌体感染的方式将重组DNA导入受体细胞。但它不会产生子代噬菌体，而是以质粒DNA的形式存在于细胞内。第63页，共128页，星期日，2025年，2月5日三、噬菌体-质粒杂合载体柯斯质粒载体的基本特点具有λ噬菌体的特性(体外包装，高效感染等)；具有质粒载体的特性(易于克隆操作、选择及高拷贝等)；具有较高容量（45kb）的克隆能力；具有与同源性序列的质粒进行重组的能力。不能体内包装，不裂解受体细胞，在细胞内不能形成噬菌体颗粒，因而不能形成噬菌斑。第64页，共128页，星期日，2025年，2月5日三、噬菌体-质粒杂合载体柯斯质粒载体的构建第65页，共128页，星期日，2025年，2月5日三、噬菌体-质粒杂合载体应用柯斯质粒载体进行基因克隆的一般程序第66页，共128页，星期日，2025年，2月5日三、噬菌体-质粒杂合载体柯斯质粒载体的克隆原理及步骤1．分离外源DNA片段35～45kb2．外源DNA与两个粘粒相连，且cos方向相同3．体外包装：在?的A蛋白的功能作用下切割cos位点并将其中的DNA包装到成熟的?噬菌体颗粒中去4．感染E.coli：线状的重组DNA被注入细胞并通过cos位点的环化，而形成粘粒载体，象质粒一样复制第67页，共128页，星期日，2025年，2月5日四、人工染色体及其应用人类、动物、植物的全基因组序列分析往往需要克隆数百甚至上千kb的DNA片段，此时考斯质粒(45kb)和噬菌体的装载量也远远不能满足需要。将细菌接合因子或酵母菌染色体上的复制区、分配区、稳定区与质粒组装在一起，即可构成染色体载体。当大片段的外源DNA克隆在这些染色体载体上后，便形成重组人造染色体，它能像天然染色体那样，在受体细胞中稳定的复制并遗传。或称为自主复制序列(ARS)第68页，共128页，星期日，2025年，2月5日四、人工染色体及其应用人工染色体载体（artificialchromosomevector）:利用染色体的复制元件来驱动外源DNA片段复制的载体。实际上是一种“穿梭”克隆载体，含有质粒克隆载体所必备的第一受体(大肠杆菌)