第三节蛋白质结构.pptVIP

用LiBH4使C末端氨基酸还原成氨基醇，然后水解，测定氨基酸，即可知C末端氨基酸。羧基末端基氨基酸测定羧基末端---硼氢化锂还原法-------------H2N-CH-CO-NH-CH-COOHH2N-CH-CO-NH-CH-CH2OHLiBH4|

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R2*当前第30页\共有86页\编于星期五\22点（2）测定步骤B.多肽链的拆分。蛋白质一级结构的测定*当前第31页\共有86页\编于星期五\22点(2)测定步骤B.多肽链的拆分。几条多肽链借助非共价键连接在一起，称为寡聚蛋白质，如，血红蛋白为四聚体，烯醇化酶为二聚体；可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍处理，即可分开多肽链(亚基).蛋白质一级结构的测定*当前第32页\共有86页\编于星期五\22点(2)测定步骤C.二硫键的断裂还原法:?-巯基乙醇(还原法)处理，使二硫键还原为巯基.SH-CH2-CH2-OH蛋白质一级结构的测定*当前第33页\共有86页\编于星期五\22点(2)测定步骤氧化法:应用过甲酸氧化法拆分多肽链间的二硫键。蛋白质一级结构的测定*当前第34页\共有86页\编于星期五\22点（2）测定步骤D.测定每条肽链的氨基酸组成根据蛋白质水解蛋白质一级结构的测定完全水解（彻底水解）不完全水解（部分水解）水解产物是aa混合物水解产物是各种大小不同的肽段和aa*当前第35页\共有86页\编于星期五\22点水解方法反应条件产物优点缺点酸水解6MHCl或4MH2SO4共煮20hrsL-aa不引起消旋Trp被破坏；一部分羟基aa(Ser,Thr)被分解；Asn和Gln的酰胺基被水解下来碱水解5MNaOH共煮20hrsL-aa和D-aa混合物不破坏Trp引起消旋；Arg脱氨基生成鸟氨酸酶水解生理温度、pH肽段和氨基酸混合物不破坏aa不引起消旋酶解时间长Table1-2*当前第36页\共有86页\编于星期五\22点（2）测定步骤E.多肽链断裂蛋白质一级结构的测定多肽链断裂法：酶解法和化学法*当前第37页\共有86页\编于星期五\22点酶解法:胰蛋白酶，糜蛋白酶，胃蛋白酶，嗜热菌蛋白酶，羧肽酶和氨肽酶多肽链的选择性降解（2）测定步骤*当前第38页\共有86页\编于星期五\22点Trypsin：R1=Lys和Arg侧链（专一性较强，水解速度快）。R2=Pro水解受抑。肽链水解位点胰蛋白酶-HN-CH-CO-NH-CH-CO-R1R2*当前第39页\共有86页\编于星期五\22点或胰凝乳蛋白酶（Chymotrypsin）：R1=Phe,Trp,Tyr时水解快;R1=Leu，Met和His水解稍慢。R2=Pro水解受抑。肽链水解位点糜蛋白酶*当前第40页\共有86页\编于星期五\22点Pepsin：R1和R2＝Phe,Trp,Tyr;Leu以及其它疏水性氨基酸水解速度较快。R1=Pro水解受抑。肽链水解位点胃蛋白酶*当前第41页\共有86页\编于星期五\22点thermolysin：R2=Phe,Trp,Tyr;Leu，Ile,Met以及其它疏水性强的氨基酸水解速度较快。R2=Pro或Gly水解受抑。R1或R3=Pro水解受抑。肽链水解位点嗜热菌蛋白酶*当前第42页\共有86页\编于星期五\22点谷氨酸蛋白酶：R1=Glu、Asp(磷酸缓冲液);R1=Glu(碳酸氢铵缓冲液或醋酸缓冲液)精氨酸蛋白酶：R1=Arg肽链水解位点谷氨酸蛋白酶和精氨酸蛋白酶*当前第43页\共有86页\编于星期五\22点化学法：可获得较大的肽段溴化氰(Cyanogenbromide)水解法。羟胺（NH2OH）：多肽链的选择性降解（2）测定步骤*当前第44页\共有86页\编于星期五\22点（2）测定步骤F.分离肽段测定每个肽段的氨基酸顺序。蛋白质一级结构的测定*当前第45页\共有86页\编于星期五\22点Edman（苯异硫氰酸酯法）氨基酸顺序分析法。Edman氨基酸顺序分析法苯乙内酰硫脲-氨基酸（PTH-aa）苯氨基硫甲酰氨基酸（2）测定步骤*