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鼠李糖乳杆菌胞外蛋白的化妆品功效研究

近年来，微生物发酵技术在化妆品原料开发中的应用受到学界及产业界的广泛关注。以雅诗兰黛“小棕瓶”精华、兰蔻“小黑瓶”面部精华液和SK-II“神仙水”为代表的产品，充分验证了该技术在化妆品产业化中的重要价值。随着化妆品行业转型升级，消费者需求已从单一功效转向对“天然、绿色、温和”特性的综合追求[1]。作为生物制造技术的重要分支，微生物发酵技术不仅能满足化妆品功效原料的开发需求，还能通过生物转化来富集活性成分、赋予产物新功能特性[2]，并有效降低天然提取物的毒性[3]。

鼠李糖乳杆菌（Lactobacillusrhamnosus），是一种革兰氏阳性益生菌，属乳杆菌属，鼠李糖亚种，常存在于人和动物的肠道内，具有厌氧、耐酸且不产芽孢的特性[4]。其显著的耐酸、耐胆汁盐及耐多种抗生素的生物学特性，使其能够在胃酸和胆汁的严苛环境中存活，并以活菌形式到达肠道，发挥益生菌功能[5，6]。鼠李糖乳杆菌可用于发酵生产乳制品、婴幼儿食品、果汁等食品，还可用于药品制备，起到调节肠道菌群、预防和治疗腹泻[7]、促进肠道健康和免疫力提升等功效[8]。作为一种不利用乳糖的乳酸菌，鼠李糖乳杆菌能够发酵产生单糖、蛋白质等多种活性物质[9，10]，具有优异的抗氧化、抗炎活性，为其作为化妆品功效原料开发提供了可能。

为探究鼠李糖乳杆菌的研究现状及其在化妆品领域的应用潜力，本研究采用文献调研法，检索了中国知网和WebofScience数据库近五年以鼠李糖乳杆菌为主题的相关文献，并利用VOSviewer软件进行关键词聚类分析。调研结果显示，当前研究热点主要集中于鼠李糖乳杆菌的抗氧化、抗炎、抑菌及益生菌特性，以及以胞外多糖为代表的活性物质，而对胞外蛋白的研究较为匮乏。为验证鼠李糖乳杆菌胞外蛋白是否具有与胞外多糖相似的抗氧化和抗炎活性，本研究通过微生物发酵法制备鼠李糖乳杆菌发酵液，并采用硫酸铵盐析法提取50%和75%两个盐浓度梯度下的胞外蛋白（ECP-Ⅰ和ECP-Ⅱ）。通过相关实验评价了ECP-Ⅰ和ECP-Ⅱ的抗氧化性、抗炎性、细胞毒性及安全性，以判断其是否符合化妆品功效原料开发的要求，并探讨其在化妆品领域的潜在应用价值。

1.1实验材料

MRS培养基，鼠李糖乳杆菌，北京和益源生物技术有限公司；硫酸铵、PBS溶液、脂多糖（LPS）、CCK-8试剂盒，北京百瑞极生物科技有限公司；ABTS试剂盒、FRAP试剂盒、TNF-α试剂盒、IL-6试剂盒、IL-8试剂盒、IL-1β试剂盒，碧云天生物技术有限公司；DPPH，Sigma公司；硫酸亚铁、水杨酸—乙醇、过氧化氢，国药集团；人永生化角质形成细胞（HaCaT细胞），中国检验检疫科学研究院；MEM培养基，美国Gibco公司。

1.2实验仪器

高压灭菌锅，上海申安医疗器械；恒温培养箱，宁波江南仪器厂；低速大容量离心机，无锡市瑞江分析仪器；ME-104E精密天平，梅特勒—托利多仪器；酶标仪，ThermoFisher科技公司；WJ-80A-Ⅱ型CO2恒温培养箱，上海圣科仪器设备有限公司。

1.3实验方法

1.3.1鼠李糖乳杆菌胞外蛋白的制备

将鼠李糖乳杆菌菌粉以3%接种量接入MRS培养基，在43℃恒温培养箱中培养24h后，在12000rpm、4℃下，离心15min，收集上清液，即得鼠李糖乳杆菌发酵液。向发酵液中加入硫酸铵（144g/L菌液），在磁力搅拌器上以200rpm、25℃搅拌均匀后，于4℃冰箱静置1—2h。在12000rpm、4℃下，离心15min后，收集上清液和蛋白沉淀，用蒸馏水溶解沉淀，制得25%盐浓度下的蛋白质溶液。因25%盐浓度下蛋白沉淀量极少，故不予收集。向上述上清液中继续加入硫酸铵（158g/L菌液、176g/L菌液），分别制备50%和75%盐浓度的溶液，重复上述搅拌、静置和离心步骤，收集蛋白沉淀并用蒸馏水溶解，分别得到50%和75%盐浓度下的鼠李糖乳杆菌胞外蛋白溶液。

将上述胞外蛋白溶液分别通过0.22μm水相滤膜过滤，装入500Da透析袋中，透析2d，每日换液3—4次。透析完成后，分别获得50%盐浓度下盐析得到的鼠李糖乳杆菌胞外蛋白（记为ECP-Ⅰ）和75%盐浓度下盐析得到的鼠李糖乳杆菌胞外蛋白（记为ECP-Ⅱ）。

1.3.2ECP-Ⅰ和ECP-Ⅱ分子量的测定

采用凝胶渗透色谱法（GPC）测定ECP-Ⅰ和ECP-Ⅱ的分子量分布。

1.3.3总抗氧化能力测定

采用ABTS试剂盒法和FRAP试剂盒法分别测定ECP-Ⅰ和ECP-Ⅱ溶液的ABTS自由基清除率和FRAP铁离子还原能力，详细操作步骤参照试剂盒说明书进行。

1.3.4DPPH自由基清除实验

准确称取8mgDPPH，溶于100mL无水乙醇，配置成2×10-4mol/L的DPPH溶液，避光保存。将ECP-Ⅰ和ECP-Ⅱ用蒸馏水稀释成