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第1页，共23页，星期日，2025年，2月5日引物设计基本原则引物长度（primerlength）产物长度（productlength）序列Tm值(meltingtemperature)G+C含量（composition）引物二聚体及发夹结构（duplexformationandhairpin）阅读框第2页，共23页，星期日，2025年，2月5日1.引物的长度一般为18-30bp，常用的是20bp左右，但不能大于38bp，因为过长会导致其延伸温度大于72℃，即Taq酶的最适温度第3页，共23页，星期日，2025年，2月5日2.扩增片段的长度扩增片段长度在普通PCR以200～500为宜；实时荧光PCR则为50～150bp。第4页，共23页，星期日，2025年，2月5日3.引物溶解温度（Tm值）引物的Tm值一般控制在55-60度,尽可能保证上下游引物的Tm值一致,一般不超过2度.如果引物中的G+C含量相对偏低,则可以使引物长度稍长,而保证一定的退火温度.Tm=2(A+T)+4(C+G)第5页，共23页，星期日，2025年，2月5日4.引物的GC含量
有效引物中(G+C)的比例为40-60%，过高（非特异性扩增0或过低（扩增效率不高）都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。第6页，共23页，星期日，2025年，2月5日5.引物自身引物间3’端的互补、二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败;引物3’端碱基，最好为G或C，形成GC夹子，提高引发效率，并提高扩增的特异性第7页，共23页，星期日，2025年，2月5日任务用绿色荧光蛋白(GFP)标记蛋白NR1第8页，共23页，星期日，2025年，2月5日SPpcDNA3.1NR1Plasmid1:Plasmid2GFP第9页，共23页，星期日，2025年，2月5日SPBamHIpcDNA3.1NR1Plasmid1:Plasmid2GFP第10页，共23页，星期日，2025年，2月5日SPBamHI(GGATCC)pcDNA3.1NR1-1aGFP第11页，共23页，星期日，2025年，2月5日121ggggctcctagagaacccgggggcgcttgaccgcgcgcgggcggcccgcgggtcgtacat181cgcgaggtcgtcgcactcgcgcaacccagagccaggcccgctgtgcccggagctcatgag241caccatgcacctgctgacattcgccctgcttttttcctgctccttcgcccgcgcggatcc301cgaccccaagatcgtcaacatcggcgcggtgctgagcacgcgcaagcatgaacagatgtt361ccgcgaggcagtaaaccaggccaataagcgacacggctcttggaagatacagctcaacgc421cacttctgtcacccacaagcccaacgccatacagatggccctgtcagtgtgtgaggacct481catctctagccaggtctacgctatcctagttagccacccgcctactcccaacgaccactt541cactcccacccctgtctcctacacagctggcttctacagaatccctgtcctgggactgac601tacccgaatgtccatctactctgacaagagtatccacctgagtttccttcgcacggtgcc661gccctactcccaccagtccagcgtctggtttgagatgatgcgagtctacaactggaacca721catcatcctgctggtcagcgacgaccacgagggacgggcagcgcagaagcgcttggagac781gttgctggaggaacgggagtccaaggcagagaaggtgctgcagtttgacccaggaaccaaNR1的编码序列(~4000bp)红色为信号肽,蓝色为BamHI酶切位
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