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附件5

免疫毒性试验方法

Immunotoxicitytest

1范围

本方法规定了动物免疫毒性试验的基本原则、要求和方法。

本方法适用于化妆品原料的免疫毒性检测。

2试验目的

本方法用于评价化妆品原料免疫毒性反应的潜在可能性。

3定义

3.1免疫毒性immunotoxicity

受试物对机体免疫系统结构与功能造成损害作用的能力，包括机体免疫系统的组织或器官损伤、免疫功能的抑制或增强。

3.2体液免疫humoralimmunity

抗原进入机体后，刺激B细胞产生效应B细胞和记忆细胞，进而产生抗体，与相应的抗原产生免疫反应。

3.3细胞免疫cell-mediatedimmunity

又称细胞介导免疫。狭义的细胞免疫仅指T细胞介导的免疫应答，即T细胞受到抗原刺激后，分化、增殖、转化为致敏T细胞，对抗原的直接杀伤作用及致敏T细胞所释放的细胞因子的协同杀伤作用。T细胞介导的免疫应答的特征是出现以单核细胞浸润为主的炎症反应和/或特异性的细胞毒性。广义的细胞免疫还包括原始的吞噬作用以及NK细胞介导的细胞毒性作用。

4试验的基本原则

本方法用于评价受试物是否改变或损伤免疫系统的机能状态。免疫毒性试验应分层级开展，初始筛选免疫毒性试验是在重复剂量毒性试验免疫毒性相关检查基础上增加淋巴细胞亚群分布、免疫球蛋白含量测定等项目。初始筛选试验提示存在免疫毒性风险时，则需开展附加免疫毒性试验。

附加免疫毒性试验时，给予不同剂量组受试物至少28d，每天对动物进行观察，记录所出现的任何临床毒性表现。给予受试物结束后处死动物，对相应的评价指标进行检测或分析。

5初始筛选免疫毒性试验

5.1初始筛选试验方法

采用初始筛选免疫毒性试验，对受试物潜在免疫毒性进行初步评估。初始筛选试验可整合至重复剂量毒性试验中。为发现免疫毒性指征，需评价以下指标：

（1）血液学检查：白细胞总数及分类计数等。

（2）血液生化检查：球蛋白、白蛋白/球蛋白比值。

（3）大体病理学检查：淋巴器官/组织。

（4）脏器重量/脏器系数：胸腺、脾脏的湿重，必要时可选代表性淋巴结进行称重，并计算脏器系数。

（5）组织病理学检查：胸腺、脾脏、骨髓（股骨、胸骨或肋软骨部位的骨髓）、有代表性的淋巴结（黏膜附近或周围淋巴结）、所有肉眼可见的损伤。

此外，免疫毒性初始筛选试验还应增加以下指标的检测：

（1）免疫球蛋白分类（IgG、IgM、IgA和IgE）水平测定。

（2）淋巴细胞亚群测定：该试验属于免疫表型分析，目的是对淋巴细胞亚型进行鉴定和计数，通常采用流式细胞仪测试。对全血、外周血或从淋巴组织分离的免疫细胞如T淋巴细胞、B淋巴细胞等进行计数；检测免疫细胞表面标志物的改变，评估CD4+和CD8+T淋巴细胞或其它亚群的数量及比值。

5.2试验结果的评价

初始筛选试验结果，应基于淋巴细胞亚群分布、免疫球蛋白分类的结果，并考虑重复剂量毒性试验中的免疫毒性相关检查，如血液学、血清免疫球蛋白含量、免疫器官重量、组织病理学（胸腺、脾、淋巴结）等结果进行综合评价。上述检查项目出现异常时，即受试物各剂量组与溶剂对照组比较存在统计学上的显著差异（但应考虑动物正常的参考范围和变化，存在毒理学意义的改变），提示受试物存在潜在免疫毒性风险，应开展附加免疫毒性试验研究，以验证受试物潜在的免疫毒性，并明确免疫细胞和免疫功能受影响的程度。

6附加免疫毒性试验

附加免疫毒性试验包括：体液免疫、特异性细胞免疫、巨噬细胞检测、NK细胞活性四个方面，每个方面应至少选择一种试验方法进行。

6.1体液免疫试验

给予受试物后用抗原免疫动物，采用抗体形成细胞试验（也称溶血空斑试验）方法或酶联免疫吸附（ELISA）检测抗体滴度的方法评价受试物对体液免疫的影响。

6.1.1抗体形成细胞试验（AntibodyPlagueFormingCell，PFC）

受试物

固体受试物应溶解或悬浮于合适的溶剂中，临用前稀释至适当浓度；液体受试物可以直接加入试验系统和/或临用前稀释至适当浓度。受试物应在临用前新鲜配制，否则须确认贮存不影响其稳定性。

实验动物及饲养环境

.1动物种系的选择

选用健康啮齿类动物，推荐使用小鼠（近交系）或大鼠。如果已知受试物对其中一种性别的动物更敏感，则应使用这种性别的动物。雌性动物应未孕、未产。试验开始时每一性别的动物体重差异应控制在±20%内。

.2动物的性别和数量

每一个剂量组和对照组至少应该有20只动物（雌雄各半）。若计划在试验过程中处死动物，则应增加计划处死的动物数。

.3饲养环境

实验动物和实验动物设施应符合国家相应规定。选用标准配合饲料，不限制饮水量。

剂量分组

至少要设三个剂量组、