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*第1页,共26页,星期日,2025年,2月5日实验目的:掌握电泳的基本原理,了解电泳仪﹑电泳槽的基本结构与功能。熟悉电泳的基本过程与定量方法。熟悉血清电泳在临床诊断中的作用。*第2页,共26页,星期日,2025年,2月5日1、电泳(electrophoresis)法带点粒子在直流电场中向着相反电极移动的现象称为电泳。*第3页,共26页,星期日,2025年,2月5日电泳原理:在一定pH条件下,不同的质点由于具有不同的等电点而带不同性质的电荷,因而在一定的电场中它们的移动方向和移动速度也不同,即它们的电泳迁移率不同,因此,可使它们分离。影响电泳迁移率的外界因素:电场强度、溶液的pH值、溶液的离子强度和电渗现象影响电泳迁移率的内在因素:质点所带净电荷的量、质点的大小和形状*第4页,共26页,星期日,2025年,2月5日常见的电泳技术:1.醋酸纤维膜电泳2.聚丙烯酰胺凝胶电泳3.琼脂糖凝胶电泳4.等电聚焦电泳5.双向电泳*第5页,共26页,星期日,2025年,2月5日采用醋酸纤维薄膜作为支持物的电泳方法称为醋酸纤维素薄膜电泳。醋酸纤维薄膜:将纤维素的羟基乙酰化为醋酸酯,溶于丙酮后制成有均一细密微孔的薄膜,其厚度为0.1~0.15mm*第6页,共26页,星期日,2025年,2月5日*第7页,共26页,星期日,2025年,2月5日优点:1.吸附作用小2.电渗作用小3.需加样量少4.亲水性小*第8页,共26页,星期日,2025年,2月5日+白蛋白(A)α1α2βγ实验原理:血清蛋白的pI大多在7.5以下,在pH8.6的巴比妥缓冲液中以负离子形式存在,并且蛋白质的分子量、立体构象、等电点以及形状也有差异,在电场中迁移速度不同,可以在醋酸纤维薄膜上分离成A、α1、α2、β和γ五条区带。蛋白名称等电点分子量白蛋白4.8869000α5.06α1:20000α2:30000β5.1290000-150000γ6.85-7.50156000-300000*第9页,共26页,星期日,2025年,2月5日三、实验器材1.电泳仪:为电泳提供直流电源。2.电泳槽:为电泳提供场所。多用有机玻璃制成,电极用铂丝。3.血清加样器:可用盖玻片或X胶片或微量加样器。4.醋酸纤维素薄膜:2cm×8cm5.其它:培养皿(直径9-10cm)、滤纸、玻璃板、镊子等。DYY-5型稳压稳流电泳仪DYY-Ⅲ型电泳槽*第10页,共26页,星期日,2025年,2月5日实验试剂巴比妥-巴比妥钠缓冲液(pH8.6、I=0.06)氨基黑10B染色液:氨基黑10B0.25g,用甲醇50mL、冰醋酸10mL、水40mL溶解(可重复使用)。漂洗液:甲醇45ml、冰醋酸5ml和蒸馏水50ml,混匀。*第11页,共26页,星期日,2025年,2月5日实验操作流程薄膜的准备电泳槽的准备点样电泳染色与漂洗脱色*第12页,共26页,星期日,2025年,2月5日操作步骤:准备:将巴比妥缓冲液加入电泳槽的电极室内,使正负极室的液面等高,电泳支架宽度正好适合醋纤薄膜的长度,用四层纱布或滤纸做盐桥,一端浸入缓冲液中,一端搭在支架上。膜的预处理:将薄膜切成2×8cm,先于膜条无光泽面距一端1.5cm处用铅笔轻划一直线(点样线),再将薄膜无光泽面向下浸泡于巴比妥缓冲液中,浸透为止(30min)。取充分浸透的膜条,将薄膜无光泽面向上,滤纸吸取多余的缓冲液,不要吸太干。*第13页,共26页,星期日,2025年,2月5日3.加样:用滴管吸取待测血清一滴于玻璃片上,用点样器末端处蘸取少许样品,垂直轻印(迅速均匀)到薄膜点样线上,使血清完全渗透至薄膜内,形成一定宽度、粗细均匀的直线。此步是实验的关键:以印章法加样时,动作应轻、稳,用力不能太重,以免将薄膜弄破或印出凹陷而影响电泳区带分离效果。点样前可先在滤纸上反复练习,掌握点样技术后再正式点样。*第14页,共26页,星期日,2025年,2月5日4.平衡:待血清渗入薄膜后,将膜条无光泽面向下置于电泳槽支架上,点样端靠近负极,薄膜两端要紧贴滤纸(点样线不要压在滤纸上),中间平直悬空,加盖密封,平衡5分钟。5.电泳:将电泳槽正负极分别与电源正负极接好。开启电源,调节电流密度为0.5mA/cm,如有10条宽2cm的膜条,其总宽度为20cm,应使用电流强度为20cm×0.5mA/cm=10mA。电压15V/cm。通电50分钟左右,关闭电源。6.染色和漂洗:取下薄膜直接浸于氨基黑10B染色液中,染色5分钟后取出,先用自来
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