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昆虫寡糖代谢关键基因的异源表达系统构建及功能验证

目录

内容概述．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．5

1.1研究背景与意义．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．6

1.1.1昆虫寡糖代谢的生物学重要性．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．8

1.1.2关键调控基因的功能挖掘价值．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．9

1.1.3异源表达系统在功能验证中的应用前景．．．．．．．．．．．．．．．．．．11

1.2国内外研究现状．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．12

1.2.1昆虫寡糖代谢相关研究的进展．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．14

1.2.2关键基因鉴定与鉴定的技术方法．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．17

1.2.3真核异源表达系统的构建与应用．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．18

1.3研究目标与内容．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．24

1.3.1主要研究目标设定．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．26

1.3.2具体研究内容概述．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．29

1.4技术路线与研究方法．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．30

1.4.1基因筛选与鉴定策略．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．33

1.4.2异源表达载体的构建途径．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．35

1.4.3表达效率优化与功能验证手段．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．36

昆虫寡糖代谢关键基因的筛选与鉴定．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．38

2.1实验材料与试剂．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．39

2.1.1昆虫种源与培养条件．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．41

2.1.2主要试剂与仪器设备．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．43

2.2基因组与转录组数据库分析．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．46

2.2.1获取目标昆虫基因组测序信息．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．50

2.2.2筛选候选寡糖代谢相关基因信息．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．52

2.3候选基因的克隆与测序．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．56

2.3.1特异性引物设计与RNA提取．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．56

2.3.2候选基因的PCR扩增与测序验证．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．59

2.4差异表达基因的筛选与分析．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．61

2.4.1关键基因在不同发育阶段的表达模式．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．62

2.4.2关键基因在不同生理状态下的表达调控．．．．．．．．．．．．．．．．．．63

异源表达载体的构建与优化．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．64

3.1表达载体的选择与改造．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．65

3.1.1适合昆虫病原体表达载体的选择依据．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．70

3.1.2表达调控元件的优化设计．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．73

3.2目的基因的亚克隆与密码子优化．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．76

3.2.1基因片段的获取与连接反应．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．78

3.2.2目的基因的密码子偏好性改造．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．82

3.3表达载体的构建与鉴定．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．84

3.3.1载体的琼脂糖凝胶电泳检测．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．87

3.3.2目的功能基因插入核苷酸序列验证．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．88

3.4表达载体的优化与表达条件研究．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．89

3.4.