SZDBZ 258-2017 肉食品中鸭源性成分实时荧光PCR检测方法.docxVIP

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SZDB/Z

深圳市标准化指导性技术文件

SZDB/Z258—2017

肉食品中鸭源性成分实时荧光PCR

检测方法

Real-timePCRfordetectionofduck-derivedingredientsinfood

2017-09-12发布2017-10-01实施

深圳市市场监督管理局发布

I

SZDB/Z258—2017

目次

前言 II

1范围 1

2规范性引用文件 1

3术语和定义 1

4缩略语 1

5原理 1

6试剂和材料 2

7主要器械和设备 2

8检验步骤 2

9质量控制 3

10结果判定与表述 3

附录A 4

II

SZDB/Z258—2017

前言

本文件按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。

本文件的附录A为资料性附录。

本文件由深圳市检验检疫科学研究院提出。

本文件由中华人民共和国深圳出入境检验检疫局归口。

本文件起草单位：深圳市检验检疫科学研究院、深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心、深圳出入境检验检疫局食品检验检疫技术中心。

本文件主要起草人：林彦星、曹琛福、黄超华、花群义、张彩虹、阮周曦、曾少灵、谢丽琪、陶虹、廖立珊。

SZDB/Z258—2017

1

肉食品中鸭源性成分实时荧光PCR检测方法

1范围

本文件规定了肉食品中鸭源性成分的实时荧光PCR检测方法。

本文件适用于肉食品中鸭源性成分的定性检测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法场地通用规范

GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

实时荧光PCRrealtimePCR

在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监控整个PCR扩增过程。3.2

Ct值cyclethreshold

每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。

4缩略语

COX3：细胞色素C氧化酶III（cytochromecoxidasesubunitIII）

DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonuleicacid）

dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleosidetriphosphate）

PCR：聚合酶链式反应（polymerasechainreaction）

ROX：6-羧基-X-罗丹明（6-Carboxyl-X-Rhodamine）

CTAB：十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrithylammoniumbromide）

Tris：三（羟甲基）氨基甲烷[tris(hydroxymethyl)aminomethane]

EDTA：乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraaceticacid）

5原理

SZDB/Z258—2017

2

样品经研磨混匀后，提取DNA，以DNA为模板，采用鸭线粒体COX3基因特异性检测引物和探针进行实时荧光PCR扩增，根据Ct值，判断样品中是否存在鸭源性成分。

6试剂和材料

6.1试剂

裂解液（参见附录A），三氯甲烷，异丙醇，75%乙醇，双蒸水。

除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂，实验用水为GB/T6682规定的二级水。所有试剂均用无DNA酶污染的容器盛装。

6.2检测用引物和探针

上游引物F：5’-CTTACTCACAACCTCAGGGCTAG-3’

下游引物R：5’-TGTAGGTGTGTGGTGGCCTT-3’

探针P：5’-FAM-CTCATCTATCCTGCTAGCCGCCG-BHQ1-3’

7主要器械和设备

高速离心机（最大离心力达12000g以上），微量移液器（10μL,100μL,1000μL），实时荧光PCR仪，恒温水浴锅，天平（感量0.001g和0.1g），涡旋振荡器，pH计。

8检验步骤

8.1样品制备

称取待检样品200mg，研磨混匀待用。

8.2样品DNA提取

称取上述混匀样品50mg于1.5mL离心管中，加入600μL～