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免疫荧光实验操作步骤详解

免疫荧光技术作为一种将抗原抗体反应的特异性与荧光标记技术的敏感性相结合的实验方法，已广泛应用于生物学、医学等领域，用于检测目标蛋白在细胞或组织内的定位与表达情况。其原理在于，利用特异性的一抗识别靶抗原，再用标记有荧光素的二抗识别一抗，最终通过荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察荧光信号，从而间接显示靶蛋白的存在与分布。要获得理想的免疫荧光结果，离不开严谨的实验设计与规范的操作流程。本文将结合实践经验，对免疫荧光实验的关键操作步骤进行详细阐述，以期为科研工作者提供有益的参考。

一、实验设计与准备：成功的基石

在正式开始实验之前，充分的准备与周密的设计是确保实验成功的前提。这不仅包括试剂、耗材的准备，更重要的是实验方案的优化。

首先，明确实验目的是核心。需要检测何种靶蛋白？在何种样本中检测（细胞系、原代细胞、组织切片等）？预期的表达模式是怎样的？这些问题的答案将直接指导后续的实验设计。

抗体的选择是免疫荧光实验成败的关键。一抗的特异性、效价以及与样本种属的匹配性至关重要。应优先选择经过验证的抗体，查阅相关文献了解其在免疫荧光实验中的应用情况。单克隆抗体特异性强，但可能只识别单一表位；多克隆抗体识别多个表位，信号可能更强，但非特异性结合的风险也相对较高。二抗的选择则需考虑与一抗的种属来源、亚型相匹配，并根据实验需求选择合适的荧光素（如FITC、Cy3、Cy5、AlexaFluor系列等），同时要注意荧光素的激发和发射波长是否与所用显微镜的滤光片兼容。如果进行多重标记，需确保所选的几种荧光素之间光谱重叠尽可能小，以避免信号干扰。

样本制备方案也需提前规划。对于细胞样本，是采用爬片、滴片还是离心甩片？对于组织样本，是冰冻切片还是石蜡切片？不同的样本处理方式对后续的固定、通透等步骤都有影响。

二、试剂与材料准备：工欲善其事，必先利其器

（一）主要试剂

1.固定液：最常用的是多聚甲醛（PFA），通常使用浓度为4%，其优点是能较好地保存细胞结构和抗原性。此外，甲醇、乙醇等也可作为固定剂，适用于某些特定抗原。

2.通透剂：当目标抗原位于细胞内时，需要使用通透剂增加细胞膜的通透性，使抗体能够进入。常用的有TritonX-100、NP-40等去污剂，以及皂素（Saponin）。通透剂的浓度和处理时间需根据样本类型和抗原定位进行优化。

3.封闭液：用于封闭样本上非特异性的蛋白结合位点，以降低背景染色。常用的封闭液为含一定浓度血清（与二抗来源无关的血清，如山羊血清、BSA）的PBS或TBS溶液，有时也会加入吐温-20（Tween-20）。

4.抗体稀释液：用于稀释一抗和二抗，通常在封闭液的基础上配制，有时会添加少量NaN?作为防腐剂（注意其毒性）。

5.洗涤缓冲液：常用PBS或TBS，并加入0.05%左右的Tween-20（PBST或TBST），用于洗涤未结合的抗体，减少背景。

6.一抗：针对目标蛋白的特异性抗体。

7.荧光标记二抗：与一抗种属对应的、标记有荧光素的抗体。

8.核复染剂（可选）：如DAPI、Hoechst等，用于标记细胞核，便于定位细胞结构。

9.封片剂：用于封片，防止样本干燥和荧光淬灭。有含抗淬灭剂的封片剂和不含抗淬灭剂的封片剂之分，建议使用前者以延长荧光信号的观察时间。

（二）主要仪器与耗材

荧光显微镜或激光共聚焦扫描显微镜、CO?培养箱（细胞培养用）、离心机、移液器及配套吸头、湿盒（可自制，用于抗体孵育以保持湿度）、载玻片、盖玻片（注意选择合适厚度，尤其是共聚焦显微镜）、染色缸、parafilm膜、镊子、刀片等。

三、详细操作步骤：精益求精，步步为营

（一）样本制备

根据样本类型的不同，样本制备的方法各异。

*细胞样本（以细胞爬片为例）：

1.提前将无菌盖玻片放入培养皿或孔板中。

2.接种适量细胞悬液，培养至所需密度。

3.实验前取出爬片，用PBS轻轻洗涤2-3次，以去除培养基残留。

*组织切片（以冰冻切片为例）：

1.新鲜组织经OCT包埋后，在冷冻切片机上切成适当厚度的切片。

2.将切片贴附于载玻片上（最好是防脱载玻片），室温晾干或冷丙酮固定后保存于-20℃或-80℃冰箱，备用。使用前需平衡至室温，并用PBS洗涤。

（二）固定（Fixation）

固定的目的是迅速终止细胞的代谢活动，保持细胞的形态结构，并尽可能保存抗原的免疫原性。

1.小心吸去或倒掉PBS。

2.加入适量固定液（如4%PFA），确保完全覆盖样本。固定时间和温度根据样本类型和固定剂种类而定。例如，细胞样本通常在室温固定15-30分钟；组织切片固定时间可能稍长。

3.固定结束后，用PBS洗涤样本3次，每次5分钟，以彻底去除固定液。

（三）通透（Perme