血清清、球蛋白分离.pptVIP

1内容实验目的1实验原理2实验材料3实验过程45注意事项现在是1页\一共有26页\编辑于星期日

2实验目的掌握盐析法分离蛋白质的原理和基本方法掌握凝胶层析法分离蛋白质的原理和基本方法掌握离子交换层析法分离蛋白质的原理和基本方法掌握醋酸纤维素薄膜电泳法的原理和基本方法了解柱层析技术现在是2页\一共有26页\编辑于星期日

实验分组四个人一小组现在是3页\一共有26页\编辑于星期日

4实验过程盐析（粗分离）葡聚糖凝胶层析（脱盐）DEAE纤维素离子交换层析（纯化）醋酸纤维素薄膜电泳（纯度鉴定）现在是4页\一共有26页\编辑于星期日

5实验材料人混合血清葡聚糖凝胶（G-25)层析柱DEAE纤维离子交换层析柱饱和硫酸铵溶液醋酸铵缓冲溶液20%磺基水杨酸1%BaCl2溶液氨基黑染色液漂洗液pH8.6巴比妥缓冲溶液电泳仪、电泳槽现在是5页\一共有26页\编辑于星期日

6实验原理蛋白质的分离和纯化是研究蛋白质化学及其生物学功能的重要手段。不同蛋白质的分子量、溶解度及等电点等都有所不同。利用这些性质的差别，可分离纯化各种蛋白质。现在是6页\一共有26页\编辑于星期日

7蛋白质的理化性质与常用的分离纯化方法蛋白质的理化性质常用的纯化方法分子质量透析、超滤凝胶层析★离心溶解度调整pH调整离子强度★降低介电常数电荷电泳★等电聚焦离子交换层析★特异结合部位亲和层析其他性质吸附层析液相层析气相层析现在是7页\一共有26页\编辑于星期日

8球蛋白?1?2??等电点4.885.065.065.126.85~7.3相对分子量（×104）6.920309~1515.6~30含量（％）57~672~54~96.2~1212~20血清蛋白的等电点、平均分子量及正常含量清蛋白A现在是8页\一共有26页\编辑于星期日

91.粗提（盐析法）由于血清中各种蛋白质分子的颗粒大小、所带电荷的多少和亲水程度不同，故盐析所需的盐浓度也不一样。调节盐的浓度可使不同的蛋白质沉淀从而达到分离的目的。血清清蛋白球蛋白半饱和硫酸铵清蛋白不沉淀，上清球蛋白沉淀，蒸馏水溶解现在是9页\一共有26页\编辑于星期日

盐析法盐析法是在蛋白质溶液中，加入无机盐至一定浓度或达饱和状态，可使蛋白质在水中溶解度降低，从而分离出来。水化膜减弱、消失。蛋白质溶液中加入中性盐后，由于中性盐与水分子的亲和力大于蛋白质，致使蛋白质分子周围的水化膜减弱乃至消失。蛋白质表面的电荷大量被中和。中性盐加入蛋白质溶液后由于离子强度发生改变，蛋白质表面的电荷大量被中和，更加导致蛋白质溶解度降低，蛋白质分子之间聚集而沉淀。现在是10页\一共有26页\编辑于星期日

112.脱盐（凝胶层析）盐析分离的蛋白质溶液中含有大量无机盐，必须先脱盐后才能进一步纯化。脱盐有多种方法，本实验采用凝胶层析法。凝胶层析法主要是根据混合物中各种物质分子大小的不同而将其分离的技术。现在是11页\一共有26页\编辑于星期日

凝胶层析分离示意图现在是12页\一共有26页\编辑于星期日

13凝胶层析分离化合物示意图现在是13页\一共有26页\编辑于星期日

143.纯化（离子交换层析）离子交换层析是指流动相中的离子和固定相上的离子进行可逆的交换，利用化合物的电荷性质及电荷量不同进行分离R-SO3-H++Pr+R-SO3-Pr++H+阳离子交换阴离子交换R-N+R3OH-+Pr-R-N+R3Pr-+OH-现在是14页\一共有26页\编辑于星期日

15球蛋白?1?2??等电点4.885.065.065.126.85~7.3相对分子量（×104）6.920309~1515.6~30含量（％）57~672~54~96.2~1212~20血清蛋白的等电点、平均分子量及正常含量清蛋白A现在是15页\一共有26页\编辑于星期日

0.06mol/LNH4AcpH6.5DEAE带正电荷清蛋白pI4.9，带负电荷多a、b球蛋白pI5.0～5.2，带负电荷少a、b球蛋白被洗脱,清蛋白仍被吸附0.02mol/LNH4AcpH6.5DEAE带正电荷清蛋白及a、b球蛋白的pI＜6.5，带负电荷g–球蛋白pI＞6.5，带正电荷清蛋白及a、b球蛋白被层析柱吸附,g-球蛋白被洗脱0.3mol/LNH4AcpH6.5DEAE带正电荷缓冲液离子强度增加清蛋白被洗脱现在是16页\一共有26页\编辑于星期日

17现在是17页\一共有26页\编辑于星期日

184.纯度鉴定（电泳）血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳结果现在是18页\一共有26页\编辑于星期日

19球蛋白?1?2??等电点4.885.065.065.126.85~7.3