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胞外多糖的提取纯化技术与功能特性研究

一、胞外多糖概述

胞外多糖（Exopolysaccharides，EPS）是微生物（细菌、真菌、藻类等）在生长代谢过程中分泌到细胞外的多糖类大分子化合物，广泛存在于发酵液、生物膜或培养基中。其化学结构多样（如葡萄糖、半乳糖、甘露糖等单糖组成的杂多糖），分子量通常在10?-10?Da之间，兼具“生物相容性好、毒性低、功能多样”等优势，已在食品、医药、化妆品、环保等领域展现出广阔应用前景（如作为增稠剂、抗氧化剂、免疫调节剂）。

二、胞外多糖的提取技术（预处理-初级分离）

胞外多糖的提取需先破除微生物与多糖的结合作用，分离多糖与发酵液中的杂质（菌体、蛋白质、小分子代谢物），核心流程分为“预处理→初级提取”两步，具体技术如下：

（一）预处理技术（去除杂质，提高提取效率）

菌体分离

离心分离法：采用高速离心机（8000-12000r/min，离心15-30min）分离发酵液中的菌体细胞，适用于细菌（如乳酸菌、芽孢杆菌）EPS提取，上清液即为含EPS的粗提液；若菌体易破碎，可添加0.1%-0.5%的叠氮钠防止菌体自溶污染。

膜过滤法：使用微滤膜（孔径0.22-0.45μm，材质为聚醚砜或醋酸纤维素）过滤发酵液，截留菌体与悬浮颗粒，优点是无剪切力、不破坏EPS结构，适合对热敏感的真菌（如酵母菌、灵芝）EPS提取。

蛋白质去除

Sevag法：向粗提液中加入氯仿-正丁醇混合液（体积比4:1），振荡30-60min后离心（3000r/min，15min），蛋白质沉淀于两相界面，上清液即为脱蛋白液；该法温和，可减少EPS损失，但需多次处理（2-3次），蛋白质去除率可达70%-85%。

酶解法：添加蛋白酶（如胰蛋白酶、木瓜蛋白酶，浓度0.1%-0.5%），在37-50℃、pH6.0-8.0条件下酶解2-4h，分解蛋白质为小分子肽，再通过离心或过滤去除；优点是特异性强，适合高蛋白质含量的EPS提取（如藻类EPS），蛋白质去除率≥80%。

小分子杂质去除

透析法：将脱蛋白后的粗提液装入透析袋（截留分子量3500-10000Da），在去离子水中透析24-48h（每6-8h更换一次水），去除盐类、单糖等小分子杂质；操作简单，但耗时较长，适合实验室小规模提取。

大孔树脂吸附法：选用D101或AB-8型大孔树脂，将粗提液以1-2BV/h的流速通过树脂柱，小分子杂质被吸附，EPS随洗脱液流出；优点是效率高，可实现连续操作，适合工业规模化生产。

（二）初级提取技术（分离EPS与溶剂）

醇沉法（最常用）

原理：利用多糖在高浓度醇溶液中溶解度降低而沉淀的特性，向预处理后的粗提液中缓慢加入无水乙醇、异丙醇或乙醇-丙酮混合液（体积比1:1），使醇浓度达到60%-80%（v/v），4℃静置12-24h，EPS形成絮状沉淀。

操作要点：搅拌速度控制在100-200r/min（避免EPS结块），沉淀后离心（5000r/min，20min）收集沉淀，用70%-80%的乙醇洗涤2-3次（去除残留杂质），真空冷冻干燥（-50℃，真空度0.1Pa）得到EPS粗品，提取率通常为0.5-5g/L（因微生物种类而异）。

超滤法

原理：使用超滤膜（截留分子量10000-100000Da，材质为聚偏氟乙烯或聚丙烯腈），在0.1-0.3MPa压力、30-40℃条件下对粗提液进行超滤浓缩，截留EPS，透过液为小分子杂质；浓缩后用去离子水透析脱盐，再冷冻干燥得到EPS。

优势：无需添加有机溶剂，环保且能保留EPS活性，适合热敏性或易氧化的EPS（如海洋微生物EPS），但设备成本较高，膜污染需定期清洗（用0.1mol/LNaOH或HCl溶液浸泡）。

盐析法

原理：向粗提液中加入中性盐（如硫酸铵、氯化钠，浓度1-3mol/L），破坏EPS的水化膜，使EPS析出；4℃静置6-12h后离心收集沉淀，用去离子水溶解后透析脱盐，干燥得到产品。

适用场景：适合酸性或碱性条件下不稳定的EPS（如某些乳酸菌EPS），但盐浓度需严格控制（过高易导致EPS变性），提取率较醇沉法低（约30%-60%）。

三、胞外多糖的纯化技术（精制-纯度提升）

初级提取的EPS仍含有少量杂多糖、色素或残留蛋白质，需通过纯化技术获得高纯度单体，常用方法如下：

（一）柱层析纯化（分离不同组分）

凝胶过滤层析（GPC）

原理：利用凝胶颗粒（如SephadexG-100、SepharoseCL-6B）的分子筛效应，将EPS按分子量大小分离；分子量较大的EPS先流出层