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病毒性腹泻标本的处理和病原检测方法

一、标本的处理

制备10％的便悬液：将粪便标本加到1.5mlEP管中，加入标本处理液，震荡3次，

每次10秒。然后静置10分钟，再以8千转/分钟离心5分钟，吸取上清进行下一步试

验或-20℃短期保存。

二、轮状病毒ELISA检测(采用DAKO轮状病毒ELISA检测试剂盒)

1、在试剂盒96孔板中每孔加入100μl便悬液离心后的上清，然后与100μl酶结

合物混合，作用1小时，将液体倒掉，并用洗液冲洗4遍，再用卫生纸拍打试剂盒板，

甩干液体。然后加100μl显色液，作用10分钟，最后加终止液。

2、结果判断：如果标本孔中为黄色，则轮状病毒检测阳性，如果是无色，则轮状

病毒阴性。

3、每次检测样本时分别设置阳性对照和阴性对照。

具体事宜请参考试剂盒说明书。

三、核酸提取(采用Geneaid病毒核酸提取试剂盒)

可用于同时提取病毒DNA和RNA。

1、在实验开始前，在ADBuffer和WashBuffer中分别加入30ml和50ml

96-100%的乙醇。

2、将200µl10％便悬液加入EP管中。

3、加400µlVBLysisBuffer至已加入便悬液的EP管中，vortex混匀。

4、室温（15～25℃）孵育10min。

5、将VB柱子放入2ml收集管中。

6、加450µl已加乙醇的ADBuffer至上述样本溶解产物中，vortex混匀。

7、小心地打开VB柱盖子，将600µl溶解混合物移至VB柱子中,注意不要弄湿柱

子边缘,盖上盖子，13000rpm离心1min。弃去滤过液，仍将柱子放入原收集管中。

8、小心地打开VB柱盖子，将剩余的样本溶解混合物移至VB柱子中，盖上盖子，

离心13000rpm1min。弃去包含有滤过液的收集管，将VB柱子放入另一新的收集管中。

9、小心地打开VB柱盖子，加400µlW1Buffer至VB柱子中，盖上盖子，离心

13000rpm30Secs。弃去滤过液，仍将柱子放入原收集管中。

10、小心地打开VB柱盖子，加600µl已加过乙醇的WashBuffer至VB柱子中，

盖上盖子，13000rpm离心30Secs。弃去收集管中滤过液。13000rpm，离心空柱子3min。

11、将干燥的VB柱放入干净的1.5mlEP管中。弃去包含有滤过液的收集管。

12、小心地打开VB柱盖子，加50µlRNase-free水至VB柱中进行洗脱，盖上盖

子，室温孵育3min，13000rpm离心1min。病毒DNA进行PCR，或贮存于－20℃或－

70℃备用。

具体事宜请参考试剂盒说明书。

四、轮状病毒分型

轮状病毒阳性的标本进一步进行基因分型，毒株分型采用逆转录－聚合酶链反应

（RT-PCR）进行。

G血清型分型，一次扩增采用编码VP7基因的保守序列设计引物（正链引物9Con1，

负链引物9Con2），扩增基因的片断，二次扩增正链引物为基因保守序列的公用引物

（9Con1），负链引物根据基因内不同血清型的特征序列设计一组分型引物（9T1、9T2、

9T3、9T4、9T9B），这样从扩增产物的特征分子量大小即可区别轮状病毒的不同血清型。

P基因型分型，其引物设计原理类似，一次扩增引物（4Con3、4Con4）选择VP4基

因内的保守序列，二次扩增负链引物选择不同基因型的特征序列，设计一组分型引物

（1T1、2T1、3T1、4T1、5T1），正链引物仍采用公用引物（4Con3）。试验所需引物序

列和设计扩增产物大小请见表1。G、P分型的具体实验操作步骤如下：

1．核酸变性

G分型时，在0.2ml的EP管中加入正链引物20μM9Con1和负链引物20μM9Con2

各1μl、RNA模板5μl、DEPC处理过的水3μl混合后放在98℃超级微量恒温器中变

性5分钟后，立即放入冰中。P分型时