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纳豆菌发酵菜用大豆中纳豆激酶的提取工艺与性质解析

一、引言

1.1研究背景与意义

心血管疾病（CVD）已然成为威胁人类健康的重要因素之一，据世界卫生组织（WHO）统计，全球每年约有1700万人死于心血管疾病，而血栓类疾病是导致心血管疾病高死亡率的关键原因。目前，临床上常用的溶栓药物，如链激酶（SK）、尿激酶（UK）和组织型纤溶酶原激活剂（t-PA），虽然在治疗血栓疾病方面具有一定疗效，但存在给药痛苦、副作用大、售价昂贵以及半衰期短等问题。因此，开发安全、高效、低成本的新型溶栓药物迫在眉睫。

纳豆激酶（nattokinase，NK）作为一种从传统发酵食品纳豆中提取的碱性丝氨酸蛋白酶，具有强大的溶解血栓能力。研究表明，纳豆激酶不仅能直接作用于交联纤维蛋白，将其水解为氨基酸及肽段，还可通过激活体内的纤溶酶原，增加体内血栓溶解因子的合成，从而发挥间接溶栓作用。与传统溶栓药物相比，纳豆激酶具有安全性高、成本低、可口服、易被人体吸收、作用时间长等优势，有望成为新一代的溶栓药物。

在食品领域，随着人们健康意识的提高，对功能性食品的需求日益增加。纳豆激酶作为一种天然的生物活性成分，可用于开发具有预防心血管疾病功能的保健食品，满足消费者对健康食品的需求。在医药领域，纳豆激酶的研究为血栓性疾病的治疗提供了新的方向和选择，具有广阔的应用前景。深入研究纳豆激酶的提取工艺及其性质，对于提高纳豆激酶的产量和质量，推动其在食品和医药领域的应用具有重要的现实意义。

1.2国内外研究现状

自1987年日本学者SUMIH等首次从纳豆中发现并提取出纳豆激酶以来，国内外学者对纳豆激酶展开了广泛而深入的研究。

在提取工艺方面，早期主要采用传统的盐析、层析等方法。如硫酸铵分级沉淀法，通过调节硫酸铵的饱和度，分段沉淀杂蛋白和目的蛋白，从而达到分离的目的。但这种方法存在操作繁琐、耗时长、蛋白质易变性等缺点。近年来，随着技术的不断进步，一些新型的提取技术逐渐被应用于纳豆激酶的提取，如超滤技术，利用小分子及水能够透过半透膜而纳豆激酶被截留的原理进行除盐和浓缩，具有操作简单、速度快、蛋白质不易变性等优点；亲和层析技术，采用融合的亲和纳米金方法对纳豆激酶进行层析分离，可得到纯度高达95%以上的纳豆激酶，但该技术成本较高，限制了其大规模应用。

在性质分析方面，研究人员对纳豆激酶的分子结构、理化性质、催化及溶栓机理等进行了深入探究。纳豆激酶基因由aprN基因编码，共编码381个氨基酸，包括信号肽、前导肽和成熟肽。其成熟肽是一条单链多肽，分子量约为27.7kDa，无半胱氨酸和二硫键，等电点为8.6，最适pH为7.0-8.0。纳豆激酶的活性受到温度、金属离子、pH等多种因素的影响，低温下活性较高，温度高于45℃时活力下降明显，Mg2?、Ca2?对其活性有激活作用，而Fe2?、Zn2?、Cu2?等则有抑制作用。

尽管国内外在纳豆激酶的研究方面取得了一定的进展，但仍存在一些不足之处。例如，现有的提取工艺在提高纳豆激酶产量和纯度的同时，往往伴随着成本的增加和操作的复杂化，难以实现大规模工业化生产；对于纳豆激酶在复杂环境下的稳定性和活性变化规律，以及其与其他生物分子的相互作用机制等方面的研究还不够深入。

1.3研究目的与内容

本研究旨在通过对纳豆菌发酵菜用大豆的研究，优化纳豆激酶的提取工艺，提高纳豆激酶的提取率和纯度，并深入分析纳豆激酶的性质，为其在食品和医药领域的进一步开发应用提供理论依据和技术支持。具体研究内容包括：

探究不同提取方法对纳豆激酶提取率和纯度的影响，优化提取工艺参数，确定最佳提取方案。通过对比传统提取方法与新型提取技术，分析各方法的优缺点，结合菜用大豆的特点，筛选出最适合的提取方法，并对其关键参数进行优化，以提高纳豆激酶的提取效果。

研究纳豆激酶的基本理化性质，如分子量、等电点、最适温度、最适pH等，以及温度、金属离子、pH等因素对纳豆激酶活性的影响规律。通过实验测定，明确纳豆激酶的理化特性，为其后续的应用提供基础数据。

分析菜用大豆的成分对纳豆激酶提取和活性的影响，探究发酵条件与纳豆激酶产量之间的关系。研究菜用大豆中蛋白质、脂肪、碳水化合物等成分在发酵过程中的变化，以及这些变化对纳豆激酶提取和活性的影响，同时优化发酵条件，提高纳豆激酶的产量。

二、纳豆菌发酵菜用大豆的基础研究

2.1纳豆菌的特性与发酵原理

纳豆菌，学名枯草芽孢杆菌纳豆亚种（Bacillussubtilisnatto），是一种革兰氏阳性菌，具有独特的生物学特性。其细胞形态通常为杆状，大小约为（0.7-0.8）μm×(2.0-3.0)μm，在葡萄糖琼脂培养基上生长时，细胞原生质染色均匀。纳豆菌具有芽孢，芽孢呈椭圆形或柱状，中生或偏中