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谋柱蛋白纯化
一、原理
镣柱里面含有琼脂糖微球体，在琼脂糖鳌合介质的作用下微球体与N0+发
生螯合，螯合后的NI2+能与HIS上的咪醴环发生特殊的相互作用，从而
实现蛋白质的分离。影响蛋白质/多肽与金属离子螯合力大小的因素主要是
蛋白质表面可结合的氨基酸（种类、数目和分布）、金属离子的种类和密
度、层析条件（、盐的种类和浓度、添加剂等）
PH
二、缓冲液的配制（500mlPH=7.4）
Bindingbuffer:PBr50ml
Nacl14.625g
20mM咪醴1.8g（5〜50mM）
Washingbuffer:PB50mM
Nacl14.625g
5mM0.45g
A10mM0.9g
15mM1.35g
20mM1.8g
40Mm3.6g
50ml
Elutionbuffer:PBfNacl14.625g
100mM9g
200mM18g
400mM咪醴45g
BOOmM咪醴63g
i/3
三、操作步骤
此步骤过镰柱的所有溶液、上清蛋白都要先用滤膜过滤，所有液体过镰
柱的速度要严格控制2.5ml/min,中间镣柱不能进气泡
、倍镰柱体积去离子水洗涤，去除空气和乙醇
2520%(5ml/min)
2、5~10倍鎳柱体积Bindingbuffer平衡
3、上蛋白样品
、倍篠柱体积洗脱杂蛋白标签含有个组氨酸，结
45Wsahingbuffer(HIS6
合能力强于含有单个组氨酸的杂蛋白)，此步骤设洗脱梯度
、倍镰柱体积洗脱目的蛋白，此步骤设洗脱梯度
55Elutiobuffer
、倍体积去离子水清洗掉缓冲液
65
7、20%乙醇保存于4C。
注意：洗脱可能会把金属离子和蛋白质的复合物一起洗下来
四、鎳柱重生(介质使用约3-20次，具体与原料来源、样品体积等有关)
1.银柱用去离子水清洗
2.5倍镣柱体积EDTA重生镰柱(20mMPB+0.5MNaCI+50mMEDTA,
pH7.4)
3.5倍体积Bindingbuffe「平衡
4.5倍体积去离子水清洗
5.20倍体积IMNaoH洗涤
6.水洗至中性
7.5倍柱体积挂镣
・
用倍体积以上的纯水清洗层析柱.去除游离的金属离子
85
2/3
9.20%乙醇保存4C。
五、注意事项
丄、推荐在中性至弱碱性的条件下（〜结合重组蛋白，磷酸盐
PH78）
Buff
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