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1第十二章荧光分析法fluorometry
概述2某些物质受到光照射时，除吸收某种波长的光之外还会发射出比原来所吸收的光的波长更长的光，这种现象称为光致发光，最常见的光致发光现象是荧光和磷光。
荧光的分类3根据物质是分子还是原子：分子荧光原子荧光根据照射光的种类：紫外荧光X射线荧光红外荧光?方法测定灵敏度10-10?10-12g/ml?
第一节基本原理4一、分子荧光（一）分子荧光的产生1．分子的电子能级与激发过程?=hc?ES0S1*T1
荧光与磷光产生示意图5S0V=0123S1*S2*VnT1*
2.荧光和磷光产生61振动弛豫vibrationalrelexation2内部能量转换internalconversion3荧光发射fluorometry6磷光的产生5体系间跨越intersystemcrossing4外部能量转换externalconversion
（二）激发光谱与发射光谱7光源单色器?1单色器?2检测器excitationspectrum?横坐标?ex，纵坐标发射光强度fluorescencespectrum?横坐标?em，纵坐标发射光强度
溶液荧光光谱通常具有如下特征8231Stokesshift荧光光谱的形状与激发波长无关荧光光谱与激发光谱的镜像关系
斯托克斯位移901?02?’03??=?-?’
荧光光谱的形状与激发波长无关不管分子激发到s1还是s2，荧光的发生总是从s1开始，荧光光谱的形状是一样的。荧光强度?(nm)400300500
荧光光谱的形状与激发波长无关11荧光强度nm250350V=01234S0S1*12340蒽的激发光谱和发射光谱
二、荧光与分子结构12fluorescencelifttime，?fFt=F0e-Kt当t=?f时，Ft=（1/e）F0荧光寿命和荧光效率即（1/e）=e-K?fK?f=1K=1/?f除去激发光源后，荧光强度降低到最大荧光强度的1/e的时间∴Ft=F0e-t/?f（1/e）F0=F0e-K?f
求荧光寿命13Ft=F0e-t/?flnF0Ftt?f=lnF0Ftt直线斜率为1?f
fluorescenceefficiency
(fluorescencequantumyield)?f=发射荧光的光子数吸收激发光的光子数
（二）有机化合物分子结构与荧光的关系15长共轭结构01分子的刚性02取代基03
1.长共轭结构16对于芳香族化合物，共轭越长，?ex和?em都长移，荧光效率也提高。?ex=205nm?em=278nm?ex=286nm?em=321nm?ex=356nm?em=404nm?f=0.11?f=0.36?f=0.29长共轭的脂肪烃也有荧光
2.分子的刚性17?f=1.0CH2同样具有???*跃迁的长共轭分子中，刚性和共平面性越大，?越大，?长移。?f=0.2
刚性和共平面性增加?电子的共轭程度增加-COO-COO-COO-O荧光素钠酚酞
原来不发生荧光的，如：8-羟基喹啉19N-OHN-OMg1/2Mg原来共平面性较好的-NCH3CH3SO3NaNCH3CH3SO3Na1-二甲氨基萘-7-磺酸盐1-二甲氨基萘-8-磺酸盐?
取代基的影响20供电子基团-NH2、-OH、-OCH301R、-SO3H、-NH3+03使??05吸电子基团-COOH、-NO2、NHCOCH302使??04影响较小06
（三）荧光试剂21邻苯二甲醛(OPA)测定无机离子的荧光试剂Dansyl-Cl荧光胺
荧光胺与脂肪族或芳香族伯胺反应22COOHONROH?-NH2R-NH2?ex275,490nm?em480nmOOOO
Dansyl-Cl与伯仲胺及酚羟基反应NCH3CH3SO2ClNCH3CH3SO2NHR+RNH2无水丙酮+HCl?ex365nm?em~500nm
邻苯二甲醛(OPA)与伯胺反应-CHO-CHO+RNH2+HSCH2CH2OHN-RSCH2CH2OH+2H2OpH9~10OH-?ex340nm?
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