第章蛋白质测序、分离及提纯.pptVIP

蛋白质的理化性质;2.6.1蛋白质的性质;现在是3页\一共有49页\编辑于星期四;2.6.2蛋白质的胶体性质;蛋白质溶液有胶体溶液的性质，如：扩散慢、易沉降、粘度大、不能透过半透膜，在水溶液中可形成亲水的胶体。

????蛋白质胶体溶液的稳定因素：水化膜、带电荷。当破坏这两个因素时，蛋白质中从溶液中析出而产生沉淀。;现在是6页\一共有49页\编辑于星期四;2.6.3变性、复性;变性的本质：

分子中各种次级键断裂，使其空间构象从紧密有序的状态变成松散无序的状态，一级结构不破坏。;（2）复性：去除变性因素回复原来结构与功能。变性并非是不可逆的变化，当变性程度较轻时，如去除变性因素，有的蛋白质仍能恢复或部分恢复其原来的构象及功能，变性的可逆变化称为复性。

（3）应用

①利用变性：

酒精消毒

高压灭菌

②防止变性：低温保存生物制品

③取代变性：乳品解毒(用于急救重金属中毒);2.6.4蛋白质的沉淀;蛋白质的沉淀

Pr从胶体溶液中析出

Ⅰ可逆沉淀：

温和条件，改变溶液pH或Pr所带电荷

Pr结构和性质没有变化

适当条件下可重新溶解

——非变性沉淀

pI沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等

;不可逆沉淀

强烈沉淀条件

破坏Pr胶体溶液稳定性

也破坏Pr结构和性质

沉淀不能再重新溶解

——变性沉淀

如加热沉淀、强酸/碱沉淀、重金属盐

和生物碱沉淀等;①.盐析法

加入中性盐脱去蛋白质的水化层，盐析一般不引起变性;②.有机溶剂沉淀

脱去水化层以及降低介电常数而增加带电质点间的相互作用

③.等电点沉淀;④.重金属盐沉淀

与带负电荷蛋白质结成不溶性盐

⑤.生物碱试剂和某些酸类沉淀

与带正电荷蛋白质生成不溶性盐

⑥.加热变性沉淀

天然结构解体，疏水基外露，

破坏水化层及带电状态;2.6.5蛋白质主要呈色反应;双缩脲反应;Folin(福林试剂）-酚试剂反应

蛋白质分子中含有一定量的酪氨酸残基，其中的酚基在碱性条件下与福林试剂的磷钼酸及磷钨酸还原成蓝色化合物。;乙醛酸反应;坂口反应;米伦反应;紫外吸收;2.7蛋白质分离提纯及分析技术;2.7.1蛋白质分子量及其确定方法;化学组成法:最低M=元素(???子)分子量/

元素(分子)百分含量

渗透压法:Mr=cRT/Π

超离心法:Mr=RTs/[(1-υρ)D]

凝胶过滤:logMr=K1-K2Ve

SDS－PAGE法:logMr=α-bμR

氨基酸序列分析计算;元素原子量(分子分子量)

最低相对分子量=

元素(分子)百分含量

肌红蛋白含铁量为0.335%，其最低分子量可

按下式算出：

Fe原子量(55.8)

最低相对分子量=

Fe元素百分含量(0.335%)

=16700;真实分子量是最低相对分子质量的n倍，这里n是每个蛋白质分子中铁原子的数目。因为肌红蛋白中，n＝l，所以其真实Mr就是16700。又如血红蛋白含铁也是0.335%，即最低Mr亦为16700，但根据其他方法测得的Mr是68000。可见每一分子血红蛋白含有四个铁原子，即n＝4，因此其真实Mr＝16700×4=66800。

;有时蛋白质分子中某一氨基酸的含量特别少，应用同样的原理，由这一氨基酸含量的分析结果，也可以计算蛋白质的最低相对分子质量。

例如牛血清清蛋白含色氨酸0.58%，计算所得的最低相对分子质量是35200。用其他方法测得的Mr是69000，所以每分子牛血清清蛋白含有两个色氨酸残基。

;2.7.2蛋白质纯化

;（一）利用溶解度差别的分离方法;2.蛋白质的盐溶和盐析

中性盐对蛋白质有明显的溶解度影响。在低

浓度时，中性盐增加蛋白质的溶解度，这种现象

称盐溶。盐溶主要由于蛋白质分子吸附某种盐类

离子后，带电表层使蛋白质彼此排斥，而蛋白质

分子与水分子之间的相互作用却加强。

盐析：在蛋白质溶液中大量加入中性盐使水

的活度降低，原来溶液中大部分自由水转变为盐

离子的水化水，从而降低蛋白质极性基团与水分

子之间的相互作用，破坏蛋白质分子表面的水化

层。;3.有机溶剂分级法;（二）根据分子大小不同的分离方法

1.过滤与膜分离;2.离心分