棉花黄萎菌拮抗细菌BDT-25抗菌蛋白的分离纯化及特性研究.docxVIP

棉花黄萎菌拮抗细菌BDT25抗菌蛋白的分离纯化及特性研究

1.引言

棉花黄萎病是由大丽轮枝菌（Verticilliumdahliae）引起的一种世界范围内的毁灭性土传病害，严重影响棉花的产量和品质。化学农药的长期使用带来了环境污染、病原菌抗药性增强等问题。生物防治作为一种绿色、可持续的防治手段，受到了广泛关注。拮抗细菌分泌的抗菌蛋白在抑制病原菌生长方面具有重要作用。本研究聚焦于棉花黄萎菌拮抗细菌BDT25抗菌蛋白，旨在通过分离纯化确定其特性，为棉花黄萎病的生物防治提供理论依据。

2.材料与方法

2.1材料

菌株：拮抗细菌BDT25由本实验室从棉花根际土壤中分离保存；棉花黄萎菌标准菌株购自中国农业微生物菌种保藏管理中心。

培养基：LB培养基用于培养拮抗细菌BDT25；PDA培养基用于培养棉花黄萎菌。

主要试剂：硫酸铵、SDSPAGE凝胶制备试剂、蛋白质纯化相关试剂等均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。

2.2方法

2.2.1抗菌蛋白的粗提取

将拮抗细菌BDT25接种于LB液体培养基中，30℃、180r/min振荡培养48h。培养物于4℃、10000r/min离心20min，取上清液。采用硫酸铵分级沉淀法，分别用30%、50%、70%和90%饱和度的硫酸铵进行沉淀，4℃静置过夜后，12000r/min离心30min，收集沉淀，用少量PBS缓冲液溶解，透析除盐，得到抗菌蛋白粗提液。

2.2.2抗菌蛋白的分离纯化

离子交换层析：将抗菌蛋白粗提液上样到DEAESepharoseFastFlow离子交换柱，用含不同浓度NaCl的PBS缓冲液进行梯度洗脱，流速为1mL/min，收集各洗脱峰，检测其抗菌活性。

凝胶过滤层析：将具有抗菌活性的洗脱峰收集液浓缩后，上样到SephadexG75凝胶过滤柱，用PBS缓冲液洗脱，流速为0.5mL/min，收集各洗脱峰，检测抗菌活性。

2.2.3抗菌蛋白的特性研究

分子量测定：采用SDSPAGE电泳法测定纯化抗菌蛋白的分子量，以标准蛋白分子量Marker为对照。

等电点测定：使用等电聚焦电泳法测定抗菌蛋白的等电点。

热稳定性：将纯化的抗菌蛋白分别在40℃、50℃、60℃、70℃、80℃和90℃处理30min，然后测定其对棉花黄萎菌的抗菌活性。

pH稳定性：将纯化的抗菌蛋白置于不同pH值（3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0）的缓冲液中处理2h，然后测定其抗菌活性。

酶敏感性：分别用蛋白酶K、胰蛋白酶和胃蛋白酶处理纯化的抗菌蛋白，然后测定其抗菌活性。

3.结果与分析

3.1抗菌蛋白的粗提取

通过硫酸铵分级沉淀，发现70%饱和度硫酸铵沉淀得到的蛋白粗提液抗菌活性最强，对棉花黄萎菌的抑菌圈直径达到（20.5±1.2）mm，而其他饱和度沉淀得到的蛋白粗提液抗菌活性较弱。

3.2抗菌蛋白的分离纯化

离子交换层析：经过DEAESepharoseFastFlow离子交换层析，得到了3个洗脱峰，其中峰Ⅱ具有较强的抗菌活性，对棉花黄萎菌的抑菌圈直径为（18.6±1.0）mm。

凝胶过滤层析：将峰Ⅱ收集液进行凝胶过滤层析，得到1个主要的洗脱峰，该洗脱峰具有明显的抗菌活性，对棉花黄萎菌的抑菌圈直径为（22.3±1.1）mm，表明该洗脱峰为纯化的抗菌蛋白。

3.3抗菌蛋白的特性研究

分子量测定：SDSPAGE电泳结果显示，纯化的抗菌蛋白分子量约为35kDa。

等电点测定：等电聚焦电泳结果表明，该抗菌蛋白的等电点约为5.8。

热稳定性：随着温度的升高，抗菌蛋白的抗菌活性逐渐降低。当温度达到80℃时，抗菌活性仍保留约60%；当温度达到90℃时，抗菌活性仅保留约30%，说明该抗菌蛋白具有一定的热稳定性。

pH稳定性：该抗菌蛋白在pH5.08.0范围内具有较高的抗菌活性，在pH7.0时抗菌活性最强；当pH低于5.0或高于8.0时，抗菌活性明显下降。

酶敏感性：蛋白酶K、胰蛋白酶和胃蛋白酶处理后，抗菌蛋白的抗菌活性均显著降低，说明该抗菌蛋白对这些酶敏感，其活性依赖于蛋白质的完整结构。

4.讨论

本研究成功从拮抗细菌BDT25中分离纯化得到一种抗菌蛋白，该蛋白对棉花黄萎菌具有较强的抑制作用。其分子量约为35kDa，等电点约为5.8，具有一定的热稳定性和较宽的pH适应范围，但对蛋白酶敏感。

与其他已报道的抗菌蛋白相比，本研究得到的抗菌蛋白在特性上有一定的差异。例如，某些抗菌蛋白热稳定性较差，在60℃处理后抗菌活性几乎丧失；而本研究的抗菌蛋白在80℃处理后仍保留约60%的抗菌活性。这可能与抗菌蛋白的氨基酸组成和结构有关。

该抗菌蛋白