第十章 物理作图.pptVIP

第1页，共29页，星期日，2025年，2月5日物理作图的方法限制酶作图(RestrictionMapping)依靠克隆的基因组作图(clone-basedmapping)荧光原位杂交(Fish,Fluorescentinsituhybridization)序标位作图(STS，Sequencetagedsite)第2页，共29页，星期日，2025年，2月5日1.限制性作图它是将限制性酶切位点标定在DNA分子的相对位置.其只能应用于较小的DNA分子,其上限取决于作图分子中限制酶位点的频率.通常采用的6碱基对识别顺序的限制酶仅适合50Kb以下DNA分子的精确作图.第3页，共29页，星期日，2025年，2月5日1.1限制酶作图(RestrictionMapping)基本原理1KbEcoRI待检的DNABamHI15Kb6Kb5Kb10Kb9KbEBBHHEHHHHE+BEB6KbEH4KbEB5KbBH第4页，共29页，星期日，2025年，2月5日第5页，共29页，星期日，2025年，2月5日方法：①用两种限制酶中的—种对DNA分子进行消化，产生片段的大小通过琼脂糖凝放电泳来检测。②第二种酶消化DNA分子，再用琼脂糖凝胶电泳检测片段大小。这些结果可以使我们弄清每种酶的限制位点数目，但切点之间的相对位置还不能确定。③将DNA分子用两种酶同时进行切割可以获得更多的信息。④作部分限制性酶解。这样会产生—套更复杂的产物，除了完全消化的，还含部分消化产物。通过测定一个不完全消化片段的大小，构造出正确的图谱。第6页，共29页，星期日，2025年，2月5日缺点通常，部分限制酶消化为构建完整的图谱提供了必需的信息。如果有多个限制位点集中、这种分析方法就显得笨拙，因为要考虑的不同片段太多。改进方法：在部分消化前将放射性或其他类型的标记物加到要分析的DNA分子两端，结果很多部分限制酶消化产物成为不可见的，因为它们不含有末端片段，因此在琼脂糖凝胶上对标记物进行筛选时不会显现。我们可以利用“可见的”部分限制片段的大小，确定出那些未定位的切点与DNA分子末端的相对位置。第7页，共29页，星期日，2025年，2月5日限制因素1.酶切位点的数目2.限制酶作图的规模受限于限制片段的大小50KB第8页，共29页，星期日，2025年，2月5日1.2限制酶作图的改进脉冲凝胶电泳(pulsed-fieldgelelectrophoresis)稀有切点限制图绘制具有7个或8个核等酸识别序列的酶

4096bp，16384BP，65536bp识别序列包含靶DNA中稀少基序的酶

基因组明显缺少某些基序：例如，人类基因组中5‘GC3’序列很稀少，这是因为人类细胞中含有一种酶，能够向这一序列中的胞嘧啶核苷的5位碳原于添加甲基基团，产生的5甲基胞嘧啶不稳定．容易脱氨基产生胸腺嘧啶。SmaI5‘CCCGGG78ｋｂＢｓｓＨＩＩ：5’GCGCGC3：390kb频ＮｏｔＩ：5‘GCCCGGCCGC3’平均约每10Mb才有一个位点。第9页，共29页，星期日，2025年，2月5日稀有切点限制图绘制注意事项:识别顺序越长产生的片段越大;识别位点碱基的组成影响限制性片段的大小;如人类基因组A/T比例接近60/%,选用高比例A/T位点限制酶,产生的片段多于高比例G/C识别位点酶有些限制酶识别位点较长如酵母的Ⅰ-Sce识别顺序为18bp,如果高等真核生物基因组中无此序列,可通过转座子转座和噬菌体转导的方法将其引入代测基因组中.基因组DNA的甲基化状态如人类活细胞基因组中大量5’-CG-3’顺序的胞嘧啶被甲基化,使许多含有5’-CG-3’顺序的内切酶很少找到可切位点.第10页，共29页，星期日，2025年，2月5日第11页，共29页，星期日，2025年，2月5日第12页，共29页，星期日，2025年，2月5日2.1大片段DNA的克隆载体YAC:酵母人工染色体230-1700KbBAC:细菌人工染色体300KbPAC:P1人工染色体300KbFosmids:30Kb2.基于克隆的基因组作图第13页，共29页，星期日，2025年，2月5日2.2重叠群组建重叠群:相互重叠的DNA片段组成的物理图.重叠群的