第三章+3-1目的基因的获得.pptVIP

***蛋白质氨基酸序列分析

蛋白一级结构测定1953年英国剑桥大学SangerF，首次报道了牛胰岛素两条多肽链的aa序列。胰岛素由A、B两条链组成， 链之间有2对二硫键， A链内有一对二硫键。目前，数万种蛋白序列已被完成，并且开始了蛋白组学研究。蛋白序列测定的策略一、多肽链数目的测定二、多肽链、或亚基的拆分三、肽链氨基酸组分测定四、多肽链的部分断裂和肽段的分离五、肽段氨基酸顺序测定六、肽段在多肽中次序的决定七、二硫键位置确定四、多肽链的部分断裂和肽段的分离Edman化学降解法只能连续降解几十个残基；然而蛋白中却含有数百个残基，所以上述分离提纯的蛋白要用专一性强的蛋白水解酶或化学试剂进行有控制的裂解，形成一些小的片段，分别进行序列分析。1.酶裂解法胰蛋白酶糜蛋白酶嗜热菌蛋白酶胃蛋白酶木瓜蛋白酶葡萄球菌蛋白酶和梭菌蛋白酶五、肽段氨基酸顺序测定 1、Edman化学降解法 2、酶解法 3、质谱法 4、根据核苷酸序列的推定法六、肽段在多肽中次序的决定如果肽链只断裂成两段或三段，那么，根据每段N端、或C-端aa的种类和序列，即可排出它的在原多肽链中的顺序。如果断裂成多条，即不能排序。必须有两种以上的方法断裂多肽，做成两套或几套肽段。这两套或几套肽段的切口彼此是错位的。氨基酸序列分析例子

一.根据基因的功能蛋白分离目的基因（三）基因分离 1.根据氨基酸序列设计简并性PCR引物或寡聚核苷酸探针

2.PCR扩增、克隆基因模板DNA

cDNA总RNART

3.筛选基因文库（C库G库）

4.免疫学法筛选表达文库

a，制备抗体

b，构建表达文库

c，筛选具有不同密码子的氨基酸密码数 氨基酸 1 MetTrp 2 PheTyrHisGlnAsnLysAspGluCys 3 Ile 4 ValProThyAlaGly 5 LeuSerArg简并寡核苷酸探针库氨基酸序列： ValAsnPheTyrAlaTrpLysATTTAAGTTAACTTCTACGCTTGGAAG寡核苷酸探针库：CGGC17核苷酸探针库（方框内，含32种序列）（2x2x2x4x1=32)利用抗体筛选表达文库

（a）把原初平板上生长的嗜菌斑及其产生的融合蛋白质原位复印转移到硝酸纤维素滤膜上；（b）滤膜与第一抗体溶液一道温浴，漂洗后加放射性标记的第二抗体继续温浴；（c）放射自显影第四部分目的基因的获得三.根据mRNA的特异性分离目的基因 (一）mRNAdifferentialdisplayPCR (DDRTPCR)第三章目的基因的获得

－目的基因的分离克隆及其方法*第三章目的基因的获得二.根据mRNA的特异性分离目的基因 （一）mRNAdifferentialdisplayPCR (DDRTPCR)* 差式显示的基本策略是通过反转录与PCR扩增mRNA中特定的一小部分，用DNA序列分析胶（6％－8％）同步分离显示扩增产物以进行比较。 首先要以5’－T（n）MN—3‘(3’固定引物．3’anchoredPrimer，其中n＝10一20，M＝dA／dC／dG，N＝dA／dC/dT／dG）作引物，将待比较的mRNA进行逆转录得到单链cDNA，由于该引物具有poly(dT），故可与mRNA的3’-poly(A)结合，而另外两个碱基MN的作用是使它定位在poly(A)5‘端．并使它只介导约1／12的mRNA的逆转录。 逆转录之后，以单链cDNA为模板，立即进行PCR，3’端引物就是上述3‘固定引物，5’端引物是10－13个碱基的随机引物。* 在细胞A中表达而不在细胞B中表达的基因．