中科院大学 分子生物学研究技术第1章分子克隆的工具酶和载体2.pdfVIP

分子生物学研究技术

柴团耀

中国科学院大学

tychai@

1

第一章

分子克隆的工具酶和载体

2

第四节质粒DNA的提取和

纯化

3

从细菌中提纯质粒DNA有多种方法，但是都包含以下3个步

骤：

1）细菌培养物的生长。

2）细菌的收获和裂解。

3）质粒DNA的纯化。

4

一、细菌培养物的生长

从琼脂平板上桃取一个单菌落，接种

到培养物中（在含有适当抗生素的液体培养基中生

长），然后从中纯化质粒。

小量制备：单菌落接种到少量培养基中（常用3mL）培养至

对数生长后期（一般过夜），部分培养物用于小量制备

质粒。

大量制备：取上述过夜培养物作为大量培养的接种物，扩大

培养。培养时间和生长情况主要依赖于质粒DNA的拷贝数

以及其复制是松弛型或严紧型。

5

二、细菌的收获和裂解

细菌的收集是通过离心来实现，而裂解有多种方法，依据

质粒大小、大肠杆菌的菌株、质粒DNA的纯化方法选择其一。

用非离子型或离子型去污剂，有机溶剂或碱处理，加热煮沸等。

6

1）大质粒（大于15kb）容易受损，故应采用温和裂解法从

细胞中释放出来。将细菌悬于蔗糖等渗溶液中，然后

用溶菌酶和EDTA进行处理，破坏细胞壁和细胞外膜，

再加入SDS一类去污剂溶解球形体。

2）小质粒可用更剧烈的方法来分离。在加入EDTA后，有

时还在加入溶菌酶后让细菌暴露于去污剂，通过煮沸

或碱处理使之裂解。破坏碱基配对，可使宿主的线状

染色体DNA变性，但闭环质粒DNA链由于处于拓扑缠绕

状态而不能彼此分开。条件恢复正常时，质粒DNA链

迅速得到准确配置，重新形成完全天然的超螺旋分子。

7

3）一些菌株（如HB101的一些变种和衍生株）用去污剂或

加热裂解时可释放相对大量的糖类，随后用氯化铯－

溴化乙锭梯度平衡离心进行质粒纯化时会有麻烦。糖

类会在梯度中紧靠超螺旋质粒DNA所占位置形成一致

密的、模糊的区带，造成质粒DNA内污染有糖类，而

糖类可抑制多种限制酶的活性。这些菌株中大量制备

质粒时，不宜使用煮沸法。

4）从表达内切核酸酶A的大肠杆菌菌株（endA+株．如

HB101）中小量制备质粒时，不要用煮沸法。煮沸不

2+

能完全灭活内切核酸酶A，以后在Mg存在下温育（如

用限制酶消化）时，质粒DNA会被降解。通过一个附

加步骤（用酚：氯仿进行抽提）可以避免此问题

8